Test klonogenny - Clonogenic assay
Test klonogenna jest techniką biologii komórki do badania skuteczności poszczególnych substancji na przeżycie i proliferację komórek. Jest często stosowany w laboratoriach badawczych nad rakiem do określania wpływu leków lub promieniowania na proliferujące komórki nowotworowe , a także do miareczkowania cząstek zabijających komórki (CKP) w zapasach wirusów. Został po raz pierwszy opracowany przez TT Pucka i Philipa I.Marcusa na University of Colorado w 1955 roku.
Chociaż ta technika może zapewnić dokładne wyniki, test jest czasochłonny w przygotowaniu i analizowaniu i może dostarczyć danych tylko o komórkach nowotworowych, które mogą rosnąć w hodowli. Słowo „klonogenne” odnosi się do faktu, że te komórki są swoimi klonami .
Procedura
Eksperyment obejmuje trzy główne etapy:
- Zabieg jest nakładany na próbkę komórek.
- Komórki umieszcza się w naczyniu do hodowli tkankowej i pozostawia do wzrostu.
- Wytworzone kolonie są utrwalane, barwione i liczone.
Na zakończenie eksperymentu mierzy się procent komórek, które przeżyły traktowanie. Graficzne przedstawienie przeżycia w funkcji stężenia leku lub dawki promieniowania jonizującego nazywa się krzywą przeżycia komórki .
W przypadku testów cząsteczek zabijających komórki frakcja komórek, które przeżyły, jest wykorzystywana do przybliżenia rozkładu Poissona cząstek wirusa między komórkami, a tym samym do określenia liczby CKP napotykanych przez każdą komórkę.
W eksperymencie można zastosować dowolny typ komórki , ale ponieważ celem tych eksperymentów w badaniach onkologicznych jest odkrycie skuteczniejszych metod leczenia raka, typowym wyborem są ludzkie komórki nowotworowe. Komórki pochodzą albo z przygotowanych „linii komórkowych”, które zostały dobrze przebadane i których ogólna charakterystyka jest znana, albo z biopsji guza u pacjenta. Komórki umieszcza się na płytkach Petriego lub na płytkach, które zawierają kilka okrągłych „dołków”. W zależności od eksperymentu wysiewana jest określona liczba komórek; w przypadku eksperymentu obejmującego napromienianie zwykle umieszcza się większą liczbę komórek wraz ze zwiększającą się dawką promieniowania. Na przykład, przy dawce promieniowania 0 lub 1 szarości , 500 komórek może być posianych, ale przy 4 lub 5 szarości, 2500 może być posianych, ponieważ bardzo duża liczba komórek jest zabijana na tym poziomie promieniowania i skutki specyficzne traktowanie byłoby nieobserwowalne.
Liczenie kolonii komórkowych odbywa się zwykle pod mikroskopem i jest dość żmudne. Ostatnio opracowano maszyny wykorzystujące algorytmy do analizy obrazów. Są one przechwytywane przez skaner obrazu lub zautomatyzowany mikroskop, który może całkowicie zautomatyzować proces liczenia. Jedna taka zautomatyzowana maszyna przyjmuje określone typy płytek komórkowych przez szczelinę (podobnie jak odtwarzacz CD), robi zdjęcie i przesyła je do komputera w celu natychmiastowej analizy. Wiarygodne liczby są dostępne w ciągu kilku sekund.
Zmienne
Leczenie zwykle polega na podaniu leku , promieniowania jonizującego lub kombinacji tych dwóch. Niektóre aktualne badania dotyczą nasilenia działania leku przez równoczesne napromienianie - efekt synergistyczny - iw tej sytuacji badane są dwie grupy: grupa kontrolna, która nie jest leczona lekiem; oraz grupę leczoną, która jest leczona lekiem. Obie grupy są napromieniowane. Jeśli nachylenia krzywych przeżycia różnią się znacznie, wówczas efekt wzmacniający może być oczywisty i można go dalej badać. Ponieważ wiele komórek nowotworowych nie wyrosnie z kolonii w hodowli, test proliferacji komórek, który według doniesień ma zadowalającą dokładność w pomiarze efektów synergicznych między promieniowaniem jonizującym a lekami, może być stosowany jako substytut
Dokładne omówienie obiecujących badań prowadzonych za pomocą tej techniki wykracza poza zakres tego tekstu, ale niektóre badania dotyczą wpływu ekspresji określonych genów lub receptorów na komórkę, odpowiedzi różnych typów komórek lub synergizmu. skutki wielu leków.