Obciążenie wirusowe - Viral load

Obciążenie wirusem , znane również jako obciążenie wirusem , jest liczbowym wyrażeniem ilości wirusa w danej objętości płynu, w tym próbek biologicznych i środowiskowych. Nie należy tego mylić z miana wirusa lub miana wirusa , który zależy od testu. Po wykonaniu testu do pomiaru zakaźnej cząstki wirusa (test płytki, test Focus), miano wirusa często odnosi się do stężenia zakaźnych cząstek wirusa, które różni się od całkowitej liczby cząstek wirusa. Płucna i osocze krwi to dwa płyny ustrojowe, z których mierzy się miano wirusa. Jako przykład próbek środowiskowych, miano wirusa norowirusa można określić na podstawie wody spływającej z produktów ogrodniczych. Norowirus nie tylko przedłużył wydalanie wirusa i ma zdolność przetrwania w środowisku, ale do wywołania infekcji u ludzi potrzebna jest niewielka dawka zakaźna: mniej niż 100 cząsteczek wirusa.

Miano wirusa jest często wyrażane jako cząstki wirusowe (wiriony) lub cząstki zakaźne na ml, w zależności od rodzaju testu. Wyższe miano wirusa, miano lub wiremia często koreluje z ciężkością aktywnej infekcji wirusowej . Ilość wirusa / ml można obliczyć przez oszacowanie żywej ilości wirusa w zaangażowanym płynie. Na przykład może być podany w kopiach RNA na mililitr osocza krwi .

Śledzenie miana wirusa służy do monitorowania leczenia podczas przewlekłych infekcji wirusowych oraz u pacjentów z obniżoną odpornością, takich jak pacjenci po przeszczepieniu szpiku kostnego lub narządu litego . Obecnie rutynowe testy są dostępne dla HIV -1, wirusa cytomegalii , wirusa zapalenia wątroby typu B, wirus, oraz wirusowemu zapaleniu wątroby typu C, wirusem. Monitorowanie wirusa HIV ma szczególne znaczenie w leczeniu osób z HIV , ponieważ jest ono stale omawiane w kontekście postępowania z HIV/AIDS . Niewykrywalne miano wirusa nie oznacza braku infekcji. Pacjenci zakażeni wirusem HIV poddawani długoterminowej skojarzonej terapii antyretrowirusowej mogą wykazywać niewykrywalne miano wirusa w większości testów klinicznych, ponieważ stężenie cząstek wirusa jest poniżej granicy wykrywalności (LOD).

Technologie testowania wiremii

Badanie przeglądowe z 2010 r. przeprowadzone przez Puren et al. klasyfikuje testy wiremii na trzy typy: (1) testy oparte na amplifikacji kwasów nukleinowych ( NAT lub NAAT) dostępne na rynku w Stanach Zjednoczonych z aprobatą Food and Drug Administration (FDA) lub na rynku w Europejskim Obszarze Gospodarczym (EOG) z oznakowanie CE ; (2) „domowe wywary” lub wewnętrzne NAT; (3) test nienukleinowy.

Testy na bazie kwasów nukleinowych (NAT)

Istnieje wiele różnych metod testów molekularnych służących do ilościowego określania miana wirusa za pomocą NAT. Materiał wyjściowy do amplifikacji można wykorzystać do podzielenia tych metod molekularnych na trzy grupy:

  1. Amplifikacja celu, która wykorzystuje sam kwas nukleinowy. Tylko kilka z bardziej powszechnych metod
    • Metoda reakcji łańcuchowej polimerazy ( PCR ) syntezy DNA in vitro wykorzystuje matrycę DNA, polimerazę , bufory, startery i nukleotydy do namnażania wirusa HIV w próbce krwi. Następnie reakcja chemiczna oznacza wirusa. Markery są mierzone i wykorzystywane do obliczenia ilości wirusa. PCR służy do ilościowego oznaczenia zintegrowanego DNA.
    • Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją ( RT-PCR ) jest odmianą PCR, którą można stosować do ilościowego oznaczania RNA wirusa. RNA jest używany jako materiał wyjściowy w tej metodzie i przekształcany w dwuniciowy DNA przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy ( RT ) do PCR.
    • Metoda amplifikacji opartej na sekwencji kwasu nukleinowego ( NASBA ) jest odmianą PCR w systemie amplifikacji opartym na transkrypcji (TAS). RNA jest używany jako cel i wykonywana jest kopia DNA. Kopia DNA jest następnie przepisywana na RNA i amplifikowana. Dostępnych jest kilka komercyjnych odmian TAS, w tym; amplifikacja za pośrednictwem transkrypcji (TMA) i samopodtrzymująca się replikacja sekwencji (3SR).
  2. Amplifikacja specyficzna dla sondy wykorzystuje sondy syntetyczne, które preferencyjnie wiążą się z sekwencją docelową. Sondy są następnie amplifikowane
  3. Wzmocnienie sygnału wykorzystuje duże ilości sygnału związanego z niewzmocnionym celem pierwotnie obecnym w próbce. Jedna powszechnie stosowana metoda:
    • Metoda rozgałęzionego DNA ( bDNA ) może wykorzystywać DNA lub RNA jako docelowy kwas nukleinowy. Krótkie sondy przymocowane do stałego podłoża i wychwytują docelowy kwas nukleinowy. Dodatkowe sondy-przedłużacze również wiążą się z docelowym kwasem nukleinowym i licznymi cząsteczkami reporterowymi, które są używane do zwiększania intensywności sygnału, który jest konwertowany na liczbę wirusów.

Próbki osocza

Osocze na EDTA jest dobrym źródłem bezkomórkowego RNA wirusa do testowania obciążenia wirusem opartego na RNA. Niezbędne jest rozważenie sposobu pobierania, przechowywania i bezpieczeństwa biologicznego próbek . Ekstrakcja RNA z osocza wymaga specjalistycznego sprzętu, odczynników i szkolenia, umieszczając go poza zasięgiem średnich i małych laboratoriów o ograniczonych zasobach. Potrzebna jest duża próbka (> 1 ml osocza) dla liniowego zakresu dochodzącego do 50 kopii/ml, co wymaga nakłucia żyły . Ten zakres liniowy jest najlepszy do monitorowania leczenia. Jeżeli wyższy zakres liniowy powyżej 1000 kopii/ml jest akceptowalny, nakłucie palca dostarczy wystarczającą ilość próbki do diagnozy zakażenia HIV w okresie niemowlęcym.

Przechowywanie

Osocze z EDTA można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 30 godzin, 14 dni w 4°C i przez dłuższy czas w -70°C bez znaczącego spadku sygnału wiremii. Według doniesień, RNA w mniejszych próbkach krwi, takich jak wysuszone plamki osocza (DPS) lub wysuszone plamki krwi (DBS) z opuszki palca, jest stabilne w temperaturze pokojowej przez okres od 4 tygodni do 1 roku. Wirus jest inaktywowany w wysuszonych próbkach, co zmniejsza niebezpieczeństwo związane z obsługą próbek. DBS i DPS zostały pomyślnie ocenione pod kątem testu wiremii, ale ich liniowy zakres wynosi 3 log10 lub 4 log10 kopii/ml. Z powodu tego braku czułości wysuszone próbki są przydatne do badań przesiewowych w kierunku HIV, ale nie do określania wiremii.

Zmierzenie

Miano wirusa jest zwykle zgłaszane jako kopie wirusa HIV w mililitrze (ml) krwi. Zmiany miana wirusa są zwykle zgłaszane jako zmiany logarytmiczne (w potęgach 10). Na przykład, wzrost o trzy rzędy wartości miana wirusa (3 log 10), co oznacza wzrost o 10 3 albo 1000 razy uprzednio podano poziomie, podczas gdy spadek od 500,000 do 500 kopii byłoby trzy log-drop (również 3 log10).

Inne czynniki wpływające na wiremię

Różne metody testowe często dają różne wyniki dla tej samej próbki pacjenta. Aby zapewnić porównywalność, tę samą metodę testową (amplifikację celu, amplifikację specyficzną dla sondy lub amplifikację sygnału) należy stosować za każdym razem, gdy badana jest próbka pacjenta. Najlepiej byłoby, gdyby badania pacjentów były przeprowadzane w tym samym laboratorium medycznym, przy użyciu tego samego testu wiremii i analizatora. Pora dnia, zmęczenie i stres mogą również wpływać na wartości wiremii. Niedawne szczepienia lub infekcje mogą wpłynąć na wynik testu wiremii. Badanie należy odroczyć o co najmniej cztery tygodnie po szczepieniu lub zakażeniu.

Bibliografia