Wyżarzanie nici zależne od syntezy - Synthesis-dependent strand annealing
Synteza zależne nici wyżarzania ( SDSA ) jest głównym mechanizmem homologii ukierunkowanej naprawy DNA dwuniciowe pęknięcia (DSB). Chociaż wiele cech SDSA zostało po raz pierwszy zasugerowanych w 1976 roku, model podwójnego połączenia Hollidaya zaproponowany w 1983 roku był faworyzowany przez wielu badaczy. W 1994 roku badania nad naprawą luki dwuniciowej u Drosophila okazały się niezgodne z modelem podwójnego połączenia Holliday'a, co skłoniło naukowców do zaproponowania modelu, który nazwali zależnym od syntezy przyłączaniem nici. Kolejne badania rekombinacji mejotycznej u S. cerevisiae wykazały, że produkty nieskrzyżowane pojawiają się wcześniej niż złącza podwójnego Holliday'a lub produkty krzyżowe, kwestionując wcześniejszy pogląd, że zarówno produkty krzyżujące, jak i nieskrzyżowane są wytwarzane przez złącza podwójnego Holliday'a i skłaniają autorów do zaproponować, aby produkty nieskrzyżowane były generowane przez SDSA.
W modelu SDSA naprawa dwuniciowych pęknięć zachodzi bez tworzenia podwójnego połączenia Holliday'a, tak że dwa procesy rekombinacji homologicznej są identyczne aż do momentu utworzenia pętli D. U drożdży pętla D jest tworzona przez inwazję nici za pomocą białek Rad51 i Rad52 , a następnie oddziałuje na nią helikaza DNA Srs2, aby zapobiec tworzeniu podwójnego połączenia Holliday'a, aby mógł wystąpić szlak SDSA. Inwazująca nić 3' jest zatem rozciągana wzdłuż homologicznego dupleksu DNA biorcy przez polimerazę DNA w kierunku od 5' do 3', tak że pętla D fizycznie przemieszcza się - proces ten określany jest jako synteza DNA migracji pęcherzyków. Powstałe pojedyncze połączenie Holliday'a następnie przesuwa się w dół dupleksu DNA w tym samym kierunku w procesie zwanym migracją gałęzi , wypierając rozciągniętą nić z nici matrycy. Ta przesunięta nić wyskakuje, tworząc nawis 3' w oryginalnym dwuniciowym dupleksie z przerwaniem, który może następnie przyłączać się do przeciwległego końca oryginalnego zerwania poprzez komplementarną parę zasad. W ten sposób synteza DNA wypełnia luki pozostałe po hybrydyzacji i wydłuża oba końce wciąż obecnego pęknięcia jednoniciowego DNA, ligując wszystkie pozostałe luki w celu wytworzenia zrekombinowanego nieskrzyżowanego DNA.
SDSA jest wyjątkowy pod tym względem, że translokacja pętli D powoduje raczej konserwatywną niż semikonserwatywną replikację , ponieważ pierwsza wydłużona nić jest wypierana ze swojej nici matrycowej , pozostawiając nienaruszony homologiczny dupleks. Dlatego też, chociaż SDSA wytwarza produkty niekrzyżowane, ponieważ markery flankujące heterodupleksowego DNA nie są wymieniane, może wystąpić konwersja genów , w której zachodzi niewzajemny transfer genetyczny między dwiema homologicznymi sekwencjami.
Enzymy wykorzystywane w SDSA podczas mejozy
Składanie filamentu nukleoproteinowego zawierającego jednoniciowy DNA (ssDNA) i homolog RecA , Rad51 , jest kluczowym etapem niezbędnym do poszukiwania homologii podczas rekombinacji . W pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae translokaza Srs2 rozkłada włókna Rad51 podczas mejozy . Poprzez bezpośrednią interakcję z Rad51, Srs2 usuwa Rad51 z włókien nukleoproteinowych, hamując w ten sposób zależne od Rad51 tworzenie cząsteczek stawowych i struktur D-loop . Ta aktywność rozkładająca jest specyficzna dla Rad51, ponieważ Srs2 nie rozkłada DMC1 (specyficzny dla mejozy homolog Rad51), Rad52 (mediator Rad 51) ani białka replikacji A ( RPA , jednoniciowego białka wiążącego DNA). Srs2 promuje nieskrzyżowany szlak SDSA, najwyraźniej poprzez regulację wiązania RAD51 podczas wymiany nici.
Rozbieżność między SDSA a złączem podwójnego Holliday'a występuje, gdy pętla D jest zdemontowana, pozwala powstającej nici na wygrzanie do drugiego wyciętego końca DSB (w modelu podwójnego złącza Holliday'a nić przesunięta przez wydłużenie pętli D do drugiego końca DSB w „2nd end capture”). Badania nad Drosophila melanogaster zidentyfikowały helikazę zespołu Blooma (Blm) jako enzym promujący rozpad pętli D. Podobnie S. cerevisiae Sgs1 An ortholog od BLM, wydaje się być głównym regulatorem większość rekombinacji zdarzeń występujących podczas S. cerevisiae mejozy . Sgs1(BLM) może rozkładać struktury pętli D analogicznie do produktów pośrednich do inwazji wczesnych nici, a zatem promować tworzenie NCO przez SDSA. Helikaza Sgs1 tworzy konserwowany kompleks z heterodimerem topoizomerazy III ( Top3 ) -RMI1 (który katalizuje pasaż pojedynczej nici DNA). Ten kompleks, zwany STR (od trzech składników), promuje wczesne tworzenie rekombinantów NCO przez SDSA podczas mejozy.
W przeglądzie Uringa et al. helikaza RTEL1 ma regulować rekombinację podczas mejozy u robaka Caenorhabditis elegans . RTEL1 jest kluczowym białkiem w naprawie DSB. Zaburza pętle D i ma promować wyniki NCO poprzez SDSA.
Liczba DSB utworzonych podczas mejozy może znacznie przekroczyć liczbę końcowych zdarzeń CO. W roślinie Arabidopsis thaliana tylko około 4% DSB jest naprawianych przez rekombinację CO, co sugeruje, że większość DSB jest naprawianych przez rekombinację NCO. Dane oparte na analizie tetrad z kilku gatunków grzybów pokazują, że tylko mniejszość (średnio około 34%) zdarzeń rekombinacyjnych podczas mejozy to COs (patrz Whitehouse, Tabele 19 i 38 dla podsumowań danych z S. cerevisiae , Podospora anserina , Sordaria fimicola i Sordaria brevicollis ). U muszki owocowej D. melanogaster podczas mejozy u samic występuje stosunek NCO do COs co najmniej 3:1. Obserwacje te wskazują, że większość zdarzeń rekombinacji podczas mejozy to NCO i sugerują, że SDSA jest głównym szlakiem rekombinacji podczas mejozy.