Barwienie srebrem - Silver staining
W patologii , barwienie srebrem jest użycie srebra do selektywnego zmieniania wyglądu celu w mikroskopii z histologicznych ; w gradiencie temperatury w elektroforezie żelowej ; oraz w żelach poliakrylamidowych .
W tradycyjnym witrażu , bejca srebrowa jest techniką wytwarzania odcieni od żółtego do pomarańczowego lub brązowego (lub zieleni na niebieskim szkle), poprzez dodanie mieszaniny zawierającej związki srebra (zwłaszcza azotan srebra ) i lekkie wypalenie. Został wprowadzony wkrótce po 1800 roku i jest „plamą” w określeniu „witraż”. Związki srebra są mieszane z substancjami wiążącymi, nakładane na powierzchnię szkła, a następnie wypalane w piecu lub piecu.
Historia
Camillo Golgi udoskonalił barwienie srebrem do badania układu nerwowego . Chociaż dokładny mechanizm chemiczny, za pomocą którego to zachodzi, nie jest znany, metoda Golgiego barwi w całości ograniczoną liczbę komórek w sposób losowy.
Barwienie srebrem zostało wprowadzone przez Kerenyi i Gallyasa jako czułą procedurę wykrywania śladowych ilości białek w żelach . Technika została rozszerzona o badanie innych makrocząsteczek biologicznych , które zostały rozdzielone na różnych podłożach.
Klasyczne barwienie błękitem Coomassie Brilliant Blue może zwykle wykryć 50 ng prążka białka; barwienie srebrem zwiększa czułość zwykle 50 razy.
Na intensywność koloru może wpływać wiele zmiennych, a każde białko ma swoją własną charakterystykę barwienia; czyste szkło, czyste odczynniki i woda o najwyższej czystości są kluczowymi punktami udanego barwienia.
Chemia
Niektóre komórki to argentaffin . Redukują one roztwór srebra do metalicznego srebra po utrwaleniu w formalinie . Inne komórki są argirofilne . Redukują one roztwór srebra do metalicznego srebra po ekspozycji na plamę zawierającą reduktor , na przykład hydrochinon lub formalinę.
Azotan srebra tworzy nierozpuszczalny fosforan srebra z jonami fosforanowymi ; metoda ta znana jest jako Stain Von Kossy . Poddany działaniu środka redukującego, zwykle hydrochinonu , tworzy czarne srebro elementarne. Służy do badania powstawania cząstek fosforanu wapnia podczas wzrostu kości.
Aplikacje
Charakterystyka histologiczna
Barwienie srebrem pomaga w wizualizacji obiektów będących przedmiotem zainteresowania, a mianowicie wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych składników komórkowych, takich jak DNA i białka , takie jak włókna kolagenu typu III i retykuliny , poprzez osadzanie cząstek metalicznego srebra na obiektach będących przedmiotem zainteresowania.
Mikrobiologia diagnostyczna
Pseudomonas , Legionella , Leptospira , H. pylori , Bartonella i Treponema oraz grzyby takie jak Pneumocystis , Cryptococcus i Candida są organizmami barwionymi srebrem.
Analiza kariotypu
W kariotypowaniu stosuje się barwienie srebrem . Azotan srebra barwi białko związane z regionem organizacji jąderkowej (NOR), tworząc ciemny region, w którym osadza się srebro, i wskazując aktywność genów rRNA w NOR. Ludzkie chromosomy 13, 14, 15, 21 i 22 mają NOR, które zwiększają aktywność barwienia srebrem co najmniej 50-krotnie.
Analiza genomowa i proteomiczna
Barwienie srebrem służy do barwienia żeli. Barwienie srebrem białek w żelach agarozowych zostało opracowane w 1973 przez Kerenyi i Gallyasa. Później został przystosowany do żeli poliakrylamidowych stosowanych w SDS-PAGE , a także do barwienia DNA czy RNA. W glikozylacji z glikoprotein i polisacharydów można utleniać za pomocą 1-godzinnej wstępnej obróbce za pomocą 0,1% kwasu nadjodowego w temperaturze 4 ° C, co poprawia wiązanie jonów srebra i wynik barwienia.
Najpierw białka są denaturowane w żelu roztworem utrwalającym 10% kwasu octowego i 30% etanolu i wytrącane, w tym samym czasie ekstrahowany jest detergent (głównie SDS ). Dyfuzji białek jest w ten sposób znacznie zmniejszone. Po wielokrotnym przemyciu wodą żel jest inkubowany w roztworze azotanu srebra . Jony srebra wiążą się z ujemnie naładowanymi łańcuchami bocznymi białek. Nadmiar jonów srebra jest następnie zmywany wodą. W końcowym etapie rozwoju jony srebra są redukowane do pierwiastkowego srebra przez dodanie alkalicznego formaldehydu . To barwi miejsca, w których obecne są białka, od brązowego do czarnego.
Intensywność barwienia zależy od pierwotnej struktury białka. Ponadto czystość używanych naczyń i odczynników wpływa na barwienie srebrem. Powszechnymi artefaktami w żelach barwionych srebrem są prążki keratyny w zakresie 54-57 kDa i 65-68 kDa jako zanieczyszczenie próbki przed elektroforezą.
Plamy srebra metenaminy
Istnieje kilka srebrników zawierających metenaminę , w tym:
- Metenamina srebrna plama Grocotta , szeroko stosowana jako ekran dla organizmów grzybowych .
- Barwienie Jonesa , srebrem metenaminy -kwasu nadjodowego-kwas Schiffa, który barwi błonę podstawną , co pozwala zobaczyć „kolcowane” GBM związane z błoniastym kłębuszkowym zapaleniem nerek .
Galeria
Barwienie srebrem ( GMS ) wykazujące histoplazmę grzyba (czarne okrągłe kulki) w biopsji wątroby.
Szereg próbek DNA z próbek Littorina plena zamplifikowanych przy użyciu PCR ze starterami ukierunkowanymi na locus zmiennej prostej sekwencji powtórzeń (SSR, inaczej mikrosatelitarnej). Próbki analizowano na 5% żelu poliakrylamidowym i wizualizowano za pomocą barwienia srebrem.
Bibliografia
Zewnętrzne linki
- MedEd w Loyola Histo/practical/stains/hp2-55.html
- [1] Hempelmann E. SDS-Protein PAGE i wykrywanie białek przez barwienie srebrem i immunoblotting białek Plasmodium falciparum. w: Moll K, Ljungström J, Perlmann H, Scherf A, Wahlgren M (red.) Methods in Malaria Research, wydanie 5, 2008, 263-266