Hodowla tkanek roślinnych - Plant tissue culture

Hodowla tkankowa roślin to zbiór technik stosowanych do utrzymywania lub hodowania komórek roślinnych, tkanek lub organów w sterylnych warunkach na pożywce hodowlanej o znanym składzie. Jest szeroko stosowany do produkcji klonów roślin metodą znaną jako mikrorozmnażanie . Różne techniki hodowli tkanek roślinnych mogą oferować pewne korzyści w porównaniu z tradycyjnymi metodami rozmnażania, w tym:

  • Produkcja dokładnych kopii roślin, które produkują szczególnie dobre kwiaty, owoce lub mają inne pożądane cechy.
  • Do szybkiego wytwarzania dojrzałych roślin.
  • Produkcja wielokrotności roślin przy braku nasion lub niezbędnych do produkcji nasion zapylaczy.
  • Regeneracja całych roślin z komórek roślinnych, które zostały genetycznie zmodyfikowane.
  • Produkcja roślin w sterylnych pojemnikach, które umożliwiają ich przemieszczanie przy znacznie zmniejszonym prawdopodobieństwie przenoszenia chorób, szkodników i patogenów.
  • Produkcja roślin z nasion, które w przeciwnym razie mają bardzo małe szanse na kiełkowanie i wzrost, np. storczyki i Nepenthes .
  • Oczyszczanie poszczególnych roślin z infekcji wirusowych i innych oraz szybkie rozmnażanie tych roślin jako „oczyszczonego inwentarza” dla ogrodnictwa i rolnictwa.

Hodowla tkanek roślinnych opiera się na fakcie, że wiele komórek roślinnych ma zdolność regeneracji całej rośliny ( totipotencja komórkowa ). Pojedyncze komórki, komórki roślinne bez ścian komórkowych ( protoplastów ), kawałki liści, łodygi lub korzenie mogą być często wykorzystywane do wytworzenia nowej rośliny na pożywce hodowlanej, przy zapewnieniu wymaganych składników odżywczych i hormonów roślinnych .

Techniki stosowane do hodowli tkanek roślinnych in vitro

Przygotowanie tkanki roślinnej do hodowli tkankowej odbywa się w warunkach aseptycznych w powietrzu z filtrem HEPA, dostarczanym przez komorę z przepływem laminarnym . Następnie tkankę hoduje się w sterylnych pojemnikach, takich jak szalki Petriego lub kolby, w pomieszczeniu wzrostowym o kontrolowanej temperaturze i natężeniu światła. Żywe materiały roślinne pochodzące ze środowiska są naturalnie skażone na ich powierzchni (a czasami wnętrzach) mikroorganizmami , dlatego ich powierzchnie są sterylizowane w roztworach chemicznych (najczęściej alkoholu i podchlorynu sodu lub wapnia ) przed pobraniem odpowiednich próbek (tzw. eksplantatów ). Sterylne eksplantaty są następnie zwykle umieszczane na powierzchni sterylnej stałej pożywki hodowlanej, ale czasami są umieszczane bezpośrednio w sterylnej pożywce płynnej, szczególnie gdy pożądane są hodowle w zawiesinie komórkowej. Podłoża stałe i płynne składają się na ogół z soli nieorganicznych oraz kilku organicznych składników odżywczych, witamin i hormonów roślinnych. Podłoża stałe są przygotowywane z podłoży płynnych z dodatkiem środka żelującego, zazwyczaj oczyszczonego agaru.

Hodowla tkankowa eksplantatów ziemniaka in vitro

Skład pożywki, w szczególności hormony roślinne i źródło azotu (azotan w porównaniu z solami amonowymi lub aminokwasami) mają głęboki wpływ na morfologię tkanek, które wyrastają z początkowego eksplantu. Na przykład nadmiar auksyny często powoduje proliferację korzeni, podczas gdy nadmiar cytokininy może dawać pędy . Równowaga zarówno auksyny, jak i cytokininy często powoduje niezorganizowany wzrost komórek lub kalusa , ale morfologia wzrostu będzie zależeć od gatunku rośliny, jak również od składu podłoża. W miarę wzrostu kultur, kawałki są zazwyczaj odcinane i przeszczepiane na nowe pożywki, aby umożliwić wzrost lub zmienić morfologię kultury. Umiejętności i doświadczenie hodowcy tkanek są ważne w ocenie, które fragmenty należy hodować, a które należy wyrzucić.

Gdy pędy wyłaniają się z kultury, można je odcinać i ukorzeniać za pomocą auksyny w celu wytworzenia sadzonek, które po osiągnięciu dojrzałości można przenieść do gleby doniczkowej w celu dalszego wzrostu w szklarni, tak jak normalne rośliny.

Ścieżki regeneracji

Roślinne kultury tkankowe uprawiane w banku nasion USDA , National Center for Genetic Resource Preservation.

Specyficzne różnice w potencjale regeneracyjnym różnych narządów i eksplantatów mają różne wyjaśnienia. Istotnymi czynnikami są różnice w stadium komórek w cyklu komórkowym , dostępność lub zdolność do transportu endogennych regulatorów wzrostu oraz zdolności metaboliczne komórek. Najczęściej stosowanymi eksplantami tkankowymi są merystematyczne końce roślin, takie jak wierzchołek łodygi, wierzchołek pąka pachowego i wierzchołek korzenia. Tkanki te charakteryzują się wysokim stopniem podziału komórek i albo koncentrują się, albo wytwarzają wymagane substancje regulujące wzrost, w tym auksyny i cytokininy.

Wydajność regeneracji pędów w kulturze tkankowej jest zwykle cechą ilościową, która często różni się między gatunkami roślin, a w obrębie gatunku rośliny między podgatunkami, odmianami, odmianami lub ekotypami . Dlatego regeneracja kultur tkankowych może się komplikować, zwłaszcza gdy trzeba opracować wiele procedur regeneracji dla różnych genotypów w obrębie tego samego gatunku.

Trzy powszechne ścieżki regeneracji kultur tkankowych roślin to propagacja z wcześniej istniejących merystemów (hodowla pędów lub kultura węzłowa), organogeneza i embriogeneza nie-zygotyczna .

Propagacja pędów lub segmentów węzłowych odbywa się zwykle w czterech etapach w celu masowej produkcji sadzonek poprzez namnażanie wegetatywne in vitro, ale organogeneza jest powszechną metodą mikropropagacji, która obejmuje regenerację tkanek narządów przybyszowych lub pąków pachowych bezpośrednio lub pośrednio z eksplantatów. Embriogeneza nie-zygotyczna jest godną uwagi ścieżką rozwojową, która jest wysoce porównywalna do embrionów zygotycznych i jest ważną ścieżką do wytwarzania wariantów somaklonalnych, opracowywania sztucznych nasion i syntezy metabolitów. Ze względu na jednokomórkowe pochodzenie zarodków niezygotycznych, są one preferowane w kilku systemach regeneracji do mikropropagacji, manipulacji ploidalnością, transferu genów i produkcji syntetycznych nasion. Niemniej jednak regeneracja tkanek poprzez organogenezę okazała się również korzystna w badaniu mechanizmów regulacyjnych rozwoju roślin.

Wybór eksplantu

Tkanka uzyskana z rośliny, która ma być hodowana, nazywana jest eksplantem.

Eksplanty mogą być pobierane z wielu różnych części rośliny, w tym z części pędów, liści, łodyg, kwiatów, korzeni, pojedynczych niezróżnicowanych komórek oraz z wielu typów dojrzałych komórek, pod warunkiem, że nadal zawierają żywą cytoplazmę i jądra i są w stanie odróżnicować i wznowić podział komórek. Dało to początek koncepcji totipotencji komórek roślinnych. Jednak nie dotyczy to wszystkich komórek lub wszystkich roślin. U wielu gatunków eksplantaty różnych narządów różnią się tempem wzrostu i regeneracji, podczas gdy niektóre w ogóle nie rosną. Wybór materiału do eksplantacji określa również, czy sadzonki wyhodowane przez hodowlę tkankową są haploidalne czy diploidalne . Ponadto nieodpowiednie eksplanty zwiększają ryzyko skażenia mikrobiologicznego.

Pierwsza metoda obejmująca merystemy i indukcję wielu pędów jest preferowaną metodą dla przemysłu mikrorozmnażania, ponieważ ryzyko zmienności somaklonalnej (zmienności genetycznej indukowanej w hodowli tkankowej) jest minimalne w porównaniu z pozostałymi dwoma metodami. Somatyczna embriogeneza to metoda, która może być kilkakrotnie wyższa w szybkości namnażania i jest podatna na obróbkę w systemach hodowli płynnych, takich jak bioreaktory.

Niektóre eksplantaty, takie jak wierzchołek korzeni , są trudne do wyizolowania i są zanieczyszczone mikroflorą glebową, która staje się problematyczna podczas procesu hodowli tkankowej. Pewna mikroflora glebowa może tworzyć ścisłe związki z systemami korzeniowymi , a nawet rosnąć w korzeniu. Cząsteczki gleby związane z korzeniami są trudne do usunięcia bez uszkodzenia korzeni, co następnie umożliwia atak drobnoustrojów. Ta powiązana mikroflora będzie generalnie przerastać pożywkę do hodowli tkankowej, zanim nastąpi znaczny wzrost tkanki roślinnej.

Niektóre hodowane tkanki rozwijają się powoli. Dla nich byłyby dwie opcje: (i) Optymalizacja pożywki hodowlanej; (ii) Hodowla wysoce wrażliwych tkanek lub odmian. Martwica może zepsuć hodowane tkanki. Generalnie odmiany roślin różnią się podatnością na martwicę kultur tkankowych. W ten sposób można nim zarządzać poprzez hodowanie wysoce reagujących odmian (lub tkanek).

Eksplanty powietrzne (nadglebowe) są również bogate w niepożądaną mikroflorę. Jednak łatwiej je usunąć z eksplantu przez delikatne płukanie, a resztę można zwykle zabić przez sterylizację powierzchniową. Większość mikroflory powierzchniowej nie tworzy ścisłych związków z tkanką roślinną . Takie skojarzenia można zwykle znaleźć na podstawie oględzin jako mozaika, odbarwienie lub zlokalizowana martwica na powierzchni eksplantu.

Alternatywą dla uzyskania nieskażonych eksplantów jest pobranie eksplantów z sadzonek, które są aseptycznie wyhodowane z nasion sterylizowanych powierzchniowo. Twarda powierzchnia nasion jest mniej przepuszczalna dla penetracji ostrych powierzchniowych środków sterylizujących, takich jak podchloryn , więc dopuszczalne warunki sterylizacji stosowane w przypadku nasion mogą być znacznie bardziej rygorystyczne niż w przypadku tkanek wegetatywnych.

Rośliny hodowane w tkankach są klonami . Jeśli pierwotna roślina mateczna użyta do produkcji pierwszych eksplantatów jest podatna na patogen lub warunki środowiskowe, cała uprawa byłaby podatna na ten sam problem. I odwrotnie, wszelkie pozytywne cechy również pozostaną w tej linii.

Zastosowania hodowli tkanek roślinnych

Hodowla tkanek roślinnych jest szeroko stosowana w naukach o roślinach, leśnictwie i ogrodnictwie. Zastosowania obejmują:

  • Komercyjna produkcja roślin wykorzystywanych jako przedmioty doniczkowe, krajobrazowe i kwiaciarskie, która wykorzystuje kulturę merystemu i pędu do produkcji dużej liczby identycznych osobników.
  • Aby oszczędzać rzadkich lub zagrożonych gatunków roślin.
  • Roślin hodowca może wykorzystywać hodowle tkankowe komórek na ekranie, a nie obiektów, dla korzystnych postaci, na przykład herbicydy oporności / tolerancji.
  • Wielkoskalowy wzrost komórek roślinnych w hodowli płynnej w bioreaktorach do produkcji cennych związków, takich jak roślinne metabolity wtórne i rekombinowane białka stosowane jako biofarmaceutyki .
  • Krzyżowanie daleko spokrewnionych gatunków poprzez fuzję protoplastów i regenerację nowej hybrydy .
  • Szybkie badanie podstaw molekularnych mechanizmów fizjologicznych, biochemicznych i reprodukcyjnych u roślin, na przykład selekcji in vitro roślin odpornych na stres.
  • Zapylanie krzyżowe daleko spokrewnionych gatunków, a następnie hodowanie tkanek powstałego zarodka, który normalnie by umarł (Embryo Rescue).
  • Do podwojenia chromosomów i indukcji poliploidii , np. podwojonych haploidów, tetraploidów i innych form poliploidów . Osiąga się to zwykle przez zastosowanie środków antymitotycznych, takich jak kolchicyna lub oryzalina .
  • Jako tkanka do transformacji, po której następuje albo krótkotrwałe testowanie konstruktów genetycznych, albo regeneracja roślin transgenicznych .
  • Pewne techniki, takie jak hodowla wierzchołków merystemów, mogą być stosowane do produkcji czystego materiału roślinnego z zakażonego materiału roślinnego, takiego jak trzcina cukrowa, ziemniaki i wiele gatunków owoców miękkich.
  • Można uzyskać produkcję identycznych sterylnych gatunków hybrydowych.
  • Produkcja sztucznych nasion na dużą skalę poprzez somatyczną embriogenezę

Laboratoria

Chociaż niektórzy hodowcy i szkółki mają własne laboratoria do rozmnażania roślin techniką hodowli tkankowej, szereg niezależnych laboratoriów świadczy niestandardowe usługi rozmnażania. Wymiana informacji o kulturach tkankowych roślin wymienia wiele komercyjnych laboratoriów hodowli tkankowych. Ponieważ hodowla tkanek roślinnych jest procesem bardzo pracochłonnym, byłby to ważny czynnik przy określaniu, które rośliny będą komercyjnie opłacalne do rozmnażania w laboratorium.

Zobacz też

Bibliografia

Uwagi

Źródła