Perfuzja maszynowa - Machine perfusion

Perfuzja maszynowa (MP) to technika stosowana przy przeszczepianiu narządów jako sposób na zachowanie narządów przeznaczonych do przeszczepu.

Perfuzja maszynowa ma różne formy i można je podzielić na kategorie według temperatury perfuzatu: zimną (4 ° C) i ciepłą (37 ° C). Perfuzję maszynową zastosowano do przeszczepów nerki , wątroby i płuc . Jest to alternatywa dla statycznej chłodni (SCS).

Historia technik konserwacji nerek

Schemat normotermicznej regionalnej perfuzji narządów jamy brzusznej podczas przygotowania do przeszczepu

Istotnym wstępem do rozwoju przechowywania i przeszczepiania nerek była praca Alexisa Carrela nad opracowaniem metod zespolenia naczyniowego . Carrel dalej opisał pierwsze przeszczepy nerek, które przeprowadzono u psów w 1902 roku; Ullman niezależnie opisał podobne eksperymenty w tym samym roku. W tych eksperymentach nerki przeszczepiono bez jakiejkolwiek próby przechowywania.

Decydującym krokiem w umożliwieniu przechowywania in vitro nerek było wykazanie przez Fuhrmana w 1943 r. Odwracalnego wpływu hipotermii na procesy metaboliczne izolowanych tkanek. Wcześniej nerki były przechowywane w normalnej temperaturze ciała przy użyciu krwi lub rozcieńczonych perfuzatów krwi, ale nie przeprowadzono udanej reimplantacji. Fuhrman wykazał, że wycinki kory nerki i mózgu szczura wytrzymywały chłodzenie do 0,2 ° C przez jedną godzinę, w której to temperaturze ich zużycie tlenu było minimalne. Po ogrzaniu plastrów do 37 ° C ich zużycie tlenu wróciło do normy.

Korzystny wpływ hipotermii na niedokrwienne nienaruszone nerki wykazał Owens w 1955 roku, kiedy wykazał, że jeśli psy były schładzane do 23-26 ° C, a ich aorty piersiowe były zamknięte przez 2 godziny, ich nerki nie wykazywały widocznych uszkodzeń, gdy psy były rozgrzane. Ten ochronny wpływ hipotermii na uszkodzenie niedokrwienne nerek został potwierdzony przez Bogardusa, który wykazał ochronny wpływ na powierzchniowe chłodzenie nerek psa, których szypułki nerkowe były zaciskane in situ przez 2 godziny. Moyer wykazał przydatność tych eksperymentów na psach na ludziach, wykazując ten sam wpływ na czynność nerek psa i człowieka w tych samych okresach hipotermicznego niedokrwienia.

Dopiero w 1958 roku wykazano, że nienaruszone psie nerki przetrwałyby niedokrwienie jeszcze lepiej, gdyby zostały schłodzone do niższych temperatur. Stueber wykazał, że nerki przetrwałyby zaciskanie szypułki in situ przez 6 godzin, gdyby zostały schłodzone do 0-5 ° C przez umieszczenie w płaszczu chłodzącym, a Schloerb wykazał, że podobna technika z chłodzeniem heparynizowanych nerek psa do 2 -4 ° C zapewniło ochronę przez 8 godzin, ale nie przez 12 godzin. Schloerb podjął również próbę przechowywania in vitro i autotransplantacji schłodzonych nerek i miał jednego długoterminowego ocalałego po 4 godzinach przechowywania nerki, a następnie ponownej implantacji i natychmiastowej nefrektomii przeciwległej . Miał również bliskiego przeżycia, po 24-godzinnym przechowywaniu nerek i opóźnionej nefrektomii przeciwstronnej, u psa, u którego rozwinęła się późna zakrzepica tętnicza w nerce.

Te metody chłodzenia powierzchniowego zostały ulepszone poprzez wprowadzenie technik, w których układ naczyniowy nerki był przepłukiwany zimnym płynem przed przechowywaniem. Miało to wpływ na zwiększenie szybkości chłodzenia nerek i usunięcie czerwonych krwinek z układu naczyniowego. Kiser zastosował tę technikę, aby osiągnąć pomyślne 7-godzinne przechowywanie in vitro nerki psa, gdy nerka została przepłukana w temperaturze 5 ° C mieszaniną dekstranu i rozcieńczonej krwi przed przechowywaniem. W 1960 r. Lapchinsky potwierdził, że podobne okresy przechowywania są możliwe, kiedy opisał osiem psów, które przeżyły po przechowywaniu ich nerek w temperaturze 2-4 ° C przez 28 godzin, po których nastąpiła autotransplantacja i opóźniona nefrektomia po przeciwnej stronie. Chociaż Lapchinsky nie podał żadnych szczegółów w swojej pracy, Humphries poinformował, że eksperymenty te obejmowały chłodzenie nerek przez 1 godzinę zimną krwią, a następnie przechowywanie w temperaturze 2-4 ° C, a następnie ogrzanie nerek przez 1 godzinę ciepłą krwią w czas reimplantacji. Przeciwległe nefrektomie zostały opóźnione o dwa miesiące.

Humphries opracował tę technikę przechowywania poprzez ciągłe perfuzowanie nerek przez cały okres przechowywania. Jako perfuzat użył rozcieńczonego osocza lub surowicy i zwrócił uwagę na konieczność stosowania niskich ciśnień perfuzatu, aby zapobiec obrzękowi nerek, ale przyznał, że optymalne wartości dla takich zmiennych, jak temperatura perfuzatu, Po 2 i przepływ, pozostają nieznane. Jego najlepszymi wynikami w tamtym czasie były 2 psy, które przeżyły po przechowywaniu nerek przez 24 godziny w temperaturze 4–10 ° C, a następnie autotransplantacji i opóźnionej nefrektomii przeciwstronnej kilka tygodni później.

Calne zakwestionował konieczność stosowania metod ciągłej perfuzji, wykazując, że udaną 12-godzinną konserwację można osiągnąć przy użyciu znacznie prostszych technik. Calne miał jedną nerkę podtrzymującą życie nawet wtedy, gdy przeciwstronna nefrektomia była wykonywana w tym samym czasie, co operacja reimplantacji. Calne jedynie heparynizowane psie nerki, a następnie przechowywane w roztworze z lodem w temperaturze 4 ° C. Chociaż wykazano, że 17-godzinna konserwacja była możliwa w jednym eksperymencie, w którym nefrektomia była opóźniona, nie osiągnięto sukcesu przy 24-godzinnym przechowywaniu.

Kolejny postęp dokonał Humphries w 1964 roku, kiedy zmodyfikował perfuzat używany w swoim oryginalnym systemie ciągłej perfuzji i miał psią nerkę zdolną do podtrzymania życia po 24-godzinnym przechowywaniu, nawet gdy w tym samym czasie wykonano natychmiastową nefrektomię przeciwległą. jako reimplantacja. W tych doświadczeniach jako perfuzat stosowano autogenną krew, rozcieńczoną 50% roztworem Tis-U-Sol w 10 ° C. Ciśnienie perfuzatu wynosiło 40 mm Hg, a pH perfuzatu 7,11-7,35 (w 37 ° C). Do natlenienia zastosowano płuco błonowe, aby uniknąć uszkodzenia krwi.

Próbując poprawić te wyniki, Manax zbadał wpływ hiperbarycznego tlenu i stwierdził, że udane 48-godzinne przechowywanie nerek psa było możliwe w temperaturze 2 ° C bez ciągłej perfuzji, kiedy nerki przepłukano dekstranem / Tis-U- Roztwór zolu przed przechowywaniem pod ciśnieniem 7,9 atmosfery, a jeśli nefrektomia przeciwna była opóźniona o 2 do 4 tygodni po ponownej implantacji. Manax postulował, że tlen hiperbaryczny może działać poprzez hamowanie metabolizmu lub wspomaganie dyfuzji tlenu do komórek nerkowych, ale nie zgłosił żadnych eksperymentów kontrolnych w celu ustalenia, czy inne aspekty jego modelu są ważniejsze niż hiperbaria.

Firma Belzer osiągnęła wyraźną poprawę czasu przechowywania w 1967 r., Kiedy opisał pomyślne przechowywanie w nerkach przez 72 godziny po powrocie do ciągłej perfuzji przy użyciu perfuzatu na bazie psiego osocza w temperaturze 8-12 ° C. Firma Belzer odkryła, że ​​kluczowym czynnikiem umożliwiającym nieskomplikowaną 72-godzinną perfuzję była krioprecypitacja osocza użytego w perfuzacie w celu zmniejszenia ilości niestabilnych lipo-białek, które w przeciwnym razie wytrącały się z roztworu i stopniowo blokowały układ naczyniowy nerek. Napowietrzania membrany była również stosowana w systemie, w dalszej próbie uniknięcia denaturacji z lipo-protein , ponieważ tylko 35% z firmy Lipo białek usunięto przez krio strącanie. Perfuzat zawierał 1 litr psiego osocza, 4 mEq siarczanu magnezu, 250 ml dekstrozy, 80 jednostek insuliny, 200 000 jednostek penicyliny i 100 mg hydrokortyzonu. Oprócz krio-strącania perfuzat był wstępnie filtrowany przez filtr 0,22 mikrona bezpośrednio przed użyciem. Firma Belzer zastosowała perfuzat pH 7,4–7,5, Po 2 150–190 mm Hg i ciśnienie skurczowe perfuzatu 50–80 mm Hg w urządzeniu wytwarzającym pulsacyjny przepływ perfuzatu. Stosując ten system, firma Belzer przeżyła 6 psów po tym, jak ich nerki były przechowywane przez 72 godziny, a następnie ponownie wszczepione, przy czym podczas operacji reimplantacji wykonywano natychmiastowe nefrektomie przeciwległe.

Zastosowanie hydrokortyzonu przez firmę Belzer jako środka wspomagającego konserwację zostało zasugerowane przez Lotke w pracy z plastrami psiej nerki, w których hydrokortyzon poprawiał zdolność skrawków do wydalania WWA i tlenu po 30 godzinach przechowywania w temperaturze 2-4 ° C; Lotke zasugerował, że hydrokortyzon może działać jako stabilizator błony lizosomalnej w tych eksperymentach. Pozostałe elementy modelu Belzera zostały ustalone empirycznie. Insulinę i magnez zastosowano częściowo w celu wywołania sztucznej hibernacji , ponieważ Suomalainen stwierdził, że reżim ten jest skuteczny w wywoływaniu hibernacji u naturalnych hibernatorów. Magnez został również dostarczony jako inhibitor metaboliczny po wykazaniu przez Kamiyamy, że był skutecznym środkiem w zachowaniu serca psa. Dodatkowym uzasadnieniem dla magnezu było to, że był on potrzebny do zastąpienia wapnia związanego cytrynianem w osoczu .

Belzer zademonstrował przydatność swoich eksperymentów na psach do przechowywania nerek u ludzi, kiedy opisał swoje doświadczenia z przeszczepami nerek u ludzi przy użyciu tych samych technik przechowywania, jakie stosował w przypadku nerek psów. Był w stanie przechowywać nerki do 50 godzin, a tylko 8% pacjentów wymagało dializy pooperacyjnej, gdy dawca był dobrze przygotowany.

W 1968 Humphries doniósł, że 1 osoba przeżyła z 14 psów po 5-dniowym przechowywaniu nerek w urządzeniu perfuzyjnym w temperaturze 10 ° C, przy użyciu rozcieńczonego osocza zawierającego dodatkowe kwasy tłuszczowe. Jednak opóźniona nefrektomia przeciwstronna 4 tygodnie po ponownej implantacji była konieczna w tych eksperymentach, aby osiągnąć sukces, co wskazywało, że nerki zostały poważnie uszkodzone podczas przechowywania.

W 1969 roku Collins doniósł o poprawie wyników, które można było osiągnąć za pomocą prostych, nieperfuzyjnych metod przechowywania w hipotermii w nerkach. Oparł swoją technikę na obserwacji Kellera, że ​​utracie elektrolitów z nerki podczas przechowywania można zapobiec, stosując płyn magazynujący zawierający kationy w ilościach zbliżonych do tych, które normalnie występują w komórkach. W modelu Collinsa psy były dobrze nawodnione przed nefrektomią, a także otrzymały mannitol w celu wywołania diurezy. Fenoksybenzaminę, środek rozszerzający naczynia krwionośne i stabilizator enzymu lizozomalnego, wstrzyknięto do tętnicy nerkowej przed nefrektomią. Natychmiast po usunięciu nerki zanurzono w solance i perfundowano przez tętnicę nerkową 100-150 ml zimnego roztworu elektrolitu z wysokości 100 cm. Nerki pozostawały w lodowatej solance przez resztę okresu przechowywania. Roztwór użyty do tych udanych zimnych perfuzji naśladował skład elektrolitów płynów wewnątrzkomórkowych, ponieważ zawierał duże ilości potasu i magnezu. Roztwór zawierał również glukozę, heparynę, prokainę i fenoksybenzaminę. PH roztworu wynosiło 7,0 w 25 ° C. Collins był w stanie osiągnąć pomyślne 24-godzinne przechowywanie 6 nerek i 30 godzin przechowywania 3 nerek, przy czym nerki funkcjonowały natychmiast po ponownej implantacji, pomimo natychmiastowych nefrektomii przeciwległych. Collins podkreślił słabe wyniki uzyskane przy przepłukiwaniu roztworem Ringera, znajdując podobne wyniki w przypadku takiego postępowania w porównaniu z nerkami leczonymi samym chłodzeniem powierzchniowym. Liu poinformował, że roztwór Collinsa może zapewnić pomyślne 48-godzinne przechowywanie, gdy roztwór został zmodyfikowany przez dodanie aminokwasów i witamin. Jednak Liu nie przeprowadził żadnych eksperymentów kontrolnych, aby wykazać, że te modyfikacje były kluczowe.

Inni pracownicy stwierdzili trudności w powtarzaniu udanych 72-godzinnych eksperymentów z przechowywaniem perfuzji przez firmę Belzer. Woods był w stanie osiągnąć pomyślne 48-godzinne przechowywanie 3 z 6 nerek, kiedy użył dodatków Belzer z krioprecypitacją osocza jako perfuzatu w hipotermicznym systemie perfuzyjnym, ale nie był w stanie przedłużyć czasu przechowywania do 72 godzin, jak to zrobił Belzer . Jednak Woods później osiągnął pomyślne przechowywanie psich nerek przez 3 i 7 dni. Woods zmodyfikował perfuzat Belzera przez dodanie 250 mg metyloprednizolonu, zwiększył zawartość siarczanu magnezu do 16,2 mEq i insuliny do 320 jednostek. Sześć z 6 nerek wykazywało funkcję podtrzymującą życie, gdy zostały ponownie wszczepione po 72 godzinach przechowywania, pomimo natychmiastowych nefrektomii po przeciwnej stronie; 1 z 2 nerek pełniła funkcję podtrzymującą życie po 96 godzinach przechowywania, 1 z 2 po 120 godzinach przechowywania i 1 z 2 po 168 godzinach przechowywania. Perfuzat ciśnienie wynosiło 60 mm Hg perfuzatu szybkością pompowania 70 uderzeń na minutę, a wartość pH perfuzyjny automatycznie utrzymywano na poziomie 7,4 za pomocą CO 2 miareczkowania. Woods podkreślił znaczenie nawodnienia zwierząt dawców i biorców. Woods stwierdził, że bez prednizolonu metylowego kruchość naczyń jest problemem, gdy czas przechowywania był dłuższy niż 48 godzin.

W 1972 roku Johnson i Claes dokonali znacznego uproszczenia technik hipotermicznego przechowywania perfuzji, wprowadzając perfuzat na bazie albuminy. Ten perfuzat wyeliminował potrzebę wytwarzania krioprecypitatu i filtracji miliporowej plazmy używanej przez firmę Belzer. Przygotowanie tego perfuzatu było pracochłonne i czasochłonne, a ponadto istniało potencjalne ryzyko związane z wirusem zapalenia wątroby i przeciwciałami cytotoksycznymi. Brak lipo-białek w perfuzacie oznaczał, że oksygenator błonowy można było wyeliminować z obwodu perfuzyjnego, ponieważ nie było potrzeby unikania interfejsu perfuzat / powietrze, aby zapobiec wytrącaniu się lipo-białek. Obaj pracownicy stosowali te same dodatki, co zalecane przez firmę Belzer.

Roztwór, którego użył Johnson, został przygotowany przez Laboratorium Produktów Krwiowych (Elstree: Anglia) przez ekstrakcję termolabilnego fibrynogenu i gamma globulin z osocza w celu uzyskania roztworu frakcji białek osocza (PPF). Roztwór inkubowano w 60 ° C przez 10 godzin w celu inaktywacji środka przeciwko zapaleniu wątroby w surowicy. W rezultacie otrzymano roztwór albuminy ludzkiej o stężeniu 45 g / l, zawierający niewielkie ilości gamma i beta globulin, który był stabilny w temperaturze od 0 ° C do 30 ° C przez 5 lat. PPF zawierał 2,2 mmol / l wolnych kwasów tłuszczowych.

Eksperymenty Johnsona dotyczyły głównie przechowywania nerek uszkodzonych przez długotrwałe ciepłe uszkodzenie. Jednak w grupie kontrolnej psich uszkodzonych nerek z powodu braku ciepła, Johnson wykazał, że 24-godzinną konserwację można było łatwo osiągnąć stosując perfuzat PPF i opisał w innym miejscu ocalałego po 72 godzinach perfuzji i ponownej implantacji z natychmiastową nefrektomią po drugiej stronie. W przypadku ciepłych uszkodzonych nerek perfuzja PPF dała lepsze wyniki niż metoda Collinsa, przy czym 6 z 6 psów przeżyło po 40 minutach ciepłego urazu i 24-godzinnym przechowywaniu, a następnie ponownej implantacji nerek i natychmiastowej nefrektomii po przeciwnej stronie. Do roztworu PPF dodano potas, magnez, insulinę, glukozę, hydrokortyzon i ampicylinę, aby zapewnić źródło energii i zapobiec wyciekowi wewnątrzkomórkowego potasu. Temperatura perfuzatu wynosiła 6 ° C, ciśnienie 40–80 mm Hg, a Po 2 200–400 mm Hg. PH utrzymywano między 7,2 a 7,4.

Claes użył perfuzatu na bazie albuminy ludzkiej (Kabi: Szwecja) rozcieńczonego solą fizjologiczną do stężenia 45 g / l. Claes zachował 4 z 5 psich nerek przez 96 godzin, przy czym nerki funkcjonowały natychmiast po ponownej implantacji, pomimo natychmiastowych nefrektomii po przeciwnej stronie. Claes porównał również ten perfuzat z osoczem poddanym krioprecypitacji Belzera w grupie kontrolnej i nie znalazł znaczącej różnicy między funkcją ponownie wszczepionych nerek w obu grupach.

Jedyną inną grupą, poza Woodsem, która zgłosiła pomyślne siedmiodniowe przechowywanie nerek, byli Liu i Humphries w 1973 r. Trzy z siedmiu psów przeżyli po tym, jak ich nerki były przechowywane przez siedem dni, po czym nastąpiła ponowna implantacja i natychmiastowa nefrektomia po drugiej stronie. Ich najlepszy pies miał szczyt kreatyniny po reimplantacji wynoszący 50 mg / l (0,44 mmol / l). Liu używał dobrze nawodnionych psów przechodzących diurezę mannitolu i przechowywał nerki w temperaturze 9 ° C - 10 ° C przy użyciu perfuzatu pochodzącego z ludzkiego PPF. PPF dalej frakcjonowano przy użyciu wysoko rozpuszczalnego w wodzie polimeru (Pluronic F-38), a do PPF dodano acetylotryptofanianu sodu i kaprylan sodu jako stabilizatory, aby umożliwić pasteryzację. Do tego roztworu dodano albuminę ludzką, heparynę, mannitol, glukozę, siarczan magnezu, chlorek potasu, insulinę, prednizolon metylowy, karbenicylinę i wodę w celu dostosowania osmolalności do 300-310  mosmoli / kg. Perfuzat wymieniono po 3,5 dniach przechowywania. Ciśnienie perfuzatu wynosiło 60 mm Hg lub mniej, przy szybkości pompowania 60 na minutę. PH perfuzatu wynosiło 7,12–7,32 (w 37 ° C), Pco2 27–47 mm Hg , a Po 2 173–219 mm Hg. W kolejnym raporcie z tego badania Humphries odkrył, że gdy eksperymenty powtarzano z nową partią PPF, nie uzyskano żadnych ocalałych, a histologia osób, które przeżyły z oryginalnego eksperymentu, wykazała hiperkomórkowość kłębuszków, którą przypisał możliwemu toksycznemu działaniu polimeru Pluronic. .

Joyce i Proctor poinformowali o pomyślnym zastosowaniu prostego perfuzatu na bazie dekstranu do przechowywania psich nerek przez 72 godziny. 10 z 17 nerek było zdolnych do życia po ponownej implantacji i natychmiastowej nefrektomii po przeciwnej stronie. Joyce zastosował perfuzję nie pulsującą w 4 ° C z perfuzatem zawierającym 2,1% Dextran 70 (Pharmacia), z dodatkowymi elektrolitami, glukozą (19,5 g / l), prokainą i hydrokortyzonem. Perfuzat nie zawierał osocza ani składników osocza. Ciśnienie perfuzatu wynosiło tylko 30 cm H 2 O, pH 7,34–7,40 i Po 2 250–400 mm Hg. Praca ta wykazała, że ​​do przechowywania przez 72 godziny nie były potrzebne żadne inne składniki odżywcze niż glukoza, a niskie ciśnienie i przepływy perfuzatu były wystarczające.

W 1973 r. Sacks wykazał, że proste przechowywanie lodu można z powodzeniem stosować do przechowywania przez 72 godziny, gdy do wstępnego chłodzenia i wypłukiwania z nerki użyto nowego roztworu płuczącego. Worki usunęły nerki dobrze nawodnionych psów, które miały diurezę po wlewie mannitolu i przepłukano nerki 200 ml roztworu z wysokości 100 cm. Następnie nerki po prostu utrzymywano w 2 ° C przez 72 godziny bez dalszej perfuzji. Po ponownej implantacji następowały natychmiastowe nefrektomie przeciwległe. Roztwór przepłukujący zaprojektowano tak, aby imitował kompozycję płynu wewnątrzkomórkowego i zawierał mannitol jako nieprzepuszczalny jon, aby dodatkowo zapobiegać puchnięciu komórek. Osmolalność roztworu wynosiła 430 mosmol / kg, a jego pH wynosiło 7,0 w 2 ° C. Dodatki stosowane przez Collinsa (dekstroza, fenoksybenzamina, prokaina i heparyna) zostały pominięte przez Sacksa.

Te wyniki zostały zrównane przez Rossa, który również osiągnął pomyślne 72-godzinne przechowywanie bez stosowania ciągłej perfuzji, chociaż nie był w stanie odtworzyć wyników Collinsa lub Sacksa przy użyciu oryginalnych roztworów Collinsa lub Sacksa. Udane rozwiązanie Rossa było podobne pod względem składu elektrolitów do płynu wewnątrzkomórkowego z dodatkiem hipertonicznego cytrynianu i mannitolu. W roztworze nie było fosforanów, wodorowęglanów, chlorków ani glukozy; osmolalność wynosiła 400 mosmol / kg, a pH 7,1. Pięć z 8 psów przeżyło reimplantację nerek i natychmiastową nefrektomię przeciwległą, gdy nerki były przechowywane przez 72 godziny po przepłukaniu roztworem Rossa; ale Ross nie był w stanie osiągnąć 7-dniowego przechowywania tą techniką, nawet jeśli zastosowano opóźnioną przeciwstronną nefrektomię.

Wymagania dotyczące pomyślnego 72-godzinnego przechowywania w hipotermii z perfuzją zostały dodatkowo zdefiniowane przez Collinsa, który wykazał, że pulsacyjna perfuzja nie była potrzebna, jeśli zastosowano ciśnienie perfuzatu 49 mm Hg, a 7 ° C była lepszą temperaturą do przechowywania niż 2 ° C lub 12 ° C. Porównał również różne kompozycje perfuzatów i odkrył, że perfuzat buforowany fosforanem może być z powodzeniem stosowany, eliminując w ten sposób potrzebę dostarczania dwutlenku węgla. Grundmann wykazał również, że niskie ciśnienie perfuzatu jest wystarczające. Użył średniego pulsacyjnego ciśnienia 20 mm Hg w 72-godzinnych perfuzjach i stwierdził, że daje to lepsze wyniki niż średnie ciśnienie 15, 40, 50 lub 60 mm Hg.

Cohen odnotował pomyślne przechowywanie do 8 dni przy użyciu różnych typów perfuzatów - z najlepszym wynikiem przy stosowaniu perfuzatu buforowanego fosforanem w temperaturze 8 ° C. Uważano, że niemożność powtórzenia tych udanych eksperymentów była spowodowana zmianami, które zostały wprowadzone w sposobie wytwarzania PPF z wyższą zawartością kwasu oktanowego, co było szkodliwe. Wykazano, że kwas oktanowy może stymulować aktywność metaboliczną podczas hipotermicznej perfuzji, co może być szkodliwe.

Charakter uszkodzenia nerek

Uraz strukturalny

Zmiany strukturalne, które pojawiają się w czasie 72 godzin hipotermicznego przechowywania wcześniej nieuszkodzone nerki zostały opisane przez Mackay, który pokazuje, jak jest to postępująca wakuolizacja w cytoplazmie komórek, które szczególnie narażone na kanalików proksymalnych . W mikroskopie elektronowym zaobserwowano obrzęk mitochondriów z wczesnym oddzieleniem wewnętrznych błon krystalicznych i późniejszą utratą całej struktury wewnętrznej. Integralność lizosomów była dobrze zachowana do późna, a zniszczenie komórki nie wydawało się być spowodowane przez enzymy lityczne, ponieważ nie było więcej uszkodzeń bezpośrednio przylegających do lizosomów niż w pozostałej części komórki.

Woods i Liu - opisując udane 5 i 7-dniowe przechowywanie w nerkach - opisali mikroskopijne zmiany widoczne pod koniec perfuzji i sekcje zwłok, ale stwierdzili kilka poważnych nieprawidłowości poza naciekami limfocytami i sporadycznymi zanikami kanalików.

Zmiany zachodzące podczas krótkich perfuzji ludzkich nerek przed reimplantacją zostały opisane przez Hilla, który wykonał również biopsje 1 godzinę po ponownej implantacji. W mikroskopie elektronowym Hill wykrył uszkodzenie śródbłonka, które korelowało z nasileniem odkładania się fibryny po ponownej implantacji. Zmiany, jakie Hill zauważył w kłębuszkach kłębuszkowych pod mikroskopem świetlnym, to sporadyczne skrzepy fibrynowe i infiltracja polimorfami. Hill podejrzewał, że zmiany te były zmianami immunologicznymi, ale stwierdził, że nie ma korelacji między ciężkością zmiany histologicznej a obecnością lub brakiem złogów immunoglobulin.

Istnieje kilka doniesień dotyczących analizy moczu wytwarzanego przez nerki podczas przechowywania perfuzji. Kastagir przeanalizował mocz wyprodukowany podczas 24-godzinnej perfuzji i stwierdził, że jest to ultrafiltrat perfuzatu, Scott znalazł śladowe ilości białka w moczu podczas 24-godzinnego przechowywania, a Pederson znalazł tylko ślad białka po 36 godzinach przechowywania perfuzji. Pederson wspomniał, że podczas wcześniejszych eksperymentów wykrył silny białkomocz. Woods zauważył odlewy białkowe w kanalikach żywych nerek po 5 dniach przechowywania, ale nie analizował moczu wytwarzanego podczas perfuzji. W badaniu Cohena obserwowano stopniowy wzrost stężenia białka w moczu podczas 8-dniowego przechowywania, aż zawartość białka w moczu zrównała się z perfuzatem. Mogło to być związane z obrzękiem błony podstawnej kłębuszków nerkowych i postępującą fuzją wyrostków nabłonkowych w stopie komórkowej, którą obserwowano również w tym samym okresie przechowywania perfuzji.

Mechanizmy obrażeń

Mechanizmy uszkadzające nerki podczas przechowywania w hipotermii można podzielić w następujący sposób:

  1. Uszkodzenie procesów metabolicznych komórki spowodowane:
    1. Zimno
    2. Niedotlenienie, gdy nerka jest ciepła, zarówno przed, jak i po okresie przechowywania w hipotermii.
    3. Niedostarczenie odpowiednich składników odżywczych.
    4. Nagromadzenie toksyn w perfuzacie.
    5. Toksyczne uszkodzenie przez płyn magazynujący.
    6. Wypłukanie niezbędnych substratów z komórek nerkowych.
  2. Uraz jądrowego DNA.
  3. Mechaniczne uszkodzenie układu naczyniowego nerki podczas hipotermicznej perfuzji.
  4. Uraz po reimplantacji.

Uszkodzenie metaboliczne

Zimno

W normalnych temperaturach mechanizmy pompowania w ścianach komórkowych zatrzymują wewnątrzkomórkowy potas w dużych ilościach i wytłaczają sód. Jeśli te pompy zawiodą, komórka pobiera sód i traci potas. Woda biernie podąża za sodem i powoduje pęcznienie komórek. Znaczenie tej kontroli obrzęku komórek wykazał McLoughlin, który stwierdził istotną korelację między zawartością wody w korze nerki psa a zdolnością nerek do podtrzymywania życia po 36-godzinnym przechowywaniu. Mechanizm pompowania jest napędzany przez układ enzymatyczny znany jako ATPaza aktywowana Na + K + i jest hamowany przez zimno. Levy odkrył, że aktywność metaboliczna w 10 ° C, na co wskazują pomiary zużycia tlenu, została zmniejszona do około 5% normalnej, a ponieważ hipotermia wpływa w podobny sposób na wszystkie układy enzymatyczne, aktywność ATPazy jest znacznie zmniejszona w 10 ° C.

Istnieją jednak różnice między tkankami i gatunkami w wrażliwości tej ATPazy na zimno, które mogą odpowiadać za różnice w zdolności tkanek do wytrzymywania hipotermii. Martin wykazał, że w komórkach kory nerki psa pewna aktywność ATPazy jest nadal obecna w 10 ° C, ale nie w 0 ° C. W komórkach wątroby i serca aktywność została całkowicie zahamowana w temperaturze 10 ° C i ta różnica w wrażliwości na zimno ATPazy korelowała z większą trudnością w kontrolowaniu obrzęku komórek podczas hipotermicznego przechowywania komórek wątroby i serca. Wyraźna ATPaza znajduje się w ścianach naczyń, co, jak wykazał Belzer, było całkowicie hamowane w temperaturze 10 ° C, gdy w tej temperaturze komórki kory nerki ATPaza jest nadal aktywna. Eksperymenty te przeprowadzono na śródbłonku aorty, ale jeśli śródbłonek naczyniowy nerki ma te same właściwości, to uszkodzenie naczyń może być czynnikiem ograniczającym przedłużone przechowywanie w nerkach.

Willis wykazał, w jaki sposób hibernatory czerpią część swojej zdolności do przetrwania w niskich temperaturach dzięki obecności Na + K + -ATPazy, która jest w stanie aktywnie transportować sód i potas przez błony komórkowe, w temperaturze 5 ° C, około sześć razy szybciej niż u osób niebędących hibernatorami ; ta szybkość transportu jest wystarczająca, aby zapobiec pęcznieniu komórek.

Szybkość schładzania tkanki może być również istotna w przypadku uszkodzenia układów enzymatycznych. Francavilla wykazała, że ​​gdy plastry wątroby zostały szybko schłodzone (natychmiastowe schłodzenie do 12 ° C w 6 minut) beztlenowa glikoliza, mierzona po podgrzaniu do 37 ° C, została zahamowana przez około 67% aktywności, która została wykazana w plastrach poddanych na opóźnione chłodzenie. Jednak skrawki nerki psa były mniej dotkliwie dotknięte szybkim chłodzeniem niż plastry wątroby.

Anoxia

Wszystkie komórki wymagają ATP jako źródła energii do swojej aktywności metabolicznej. Nerka ulega uszkodzeniu w wyniku niedotlenienia, gdy komórki korowe nerki nie są w stanie wytworzyć wystarczającej ilości ATP w warunkach beztlenowych, aby zaspokoić potrzeby komórek. Podczas wycinania nerki nieuniknione jest niedotlenienie w okresie między podziałem tętnicy nerkowej a ochłodzeniem nerki. Bergstrom wykazał, że 50% zawartości ATP w korze nerki psa jest tracone w ciągu 1 minuty od zaciśnięcia tętnicy nerkowej. Podobne wyniki uzyskał Warnick w całych nerkach myszy, ze spadkiem ATP komórkowego o 50% po około 30 sekund ciepłej anoksji. Warnick i Bergstrom wykazali również, że ochłodzenie nerki natychmiast po usunięciu znacznie zmniejszyło dalszą utratę ATP. Kiedy te nerki, które nie zostały uszkodzone przez ciepło, były perfundowane natlenionym osoczem hipotermicznym, poziomy ATP zmniejszyły się o 50% po 24-godzinnym przechowywaniu, a po 48 godzinach średnie poziomy ATP w tkankach były nieco wyższe, co wskazuje, że nastąpiła synteza ATP. Pegg wykazał, że nerki królika mogą resyntetyzować ATP po okresie przechowywania perfuzji po urazie ciepłym, ale nie doszło do resyntezy w nerkach, które nie zostały uszkodzone przez ciepło.

Ciepła anoksja może również wystąpić podczas ponownej implantacji nerki po przechowywaniu. Lannon wykazał poprzez pomiary metabolizmu bursztynianu, jak nerka była bardziej wrażliwa na okres ciepłego niedotlenienia występującego po przechowywaniu niż na ten sam okres ciepłego niedotlenienia występującego bezpośrednio przed przechowywaniem.

Brak niezbędnych składników odżywczych

Aktywny metabolizm glukozy z produkcją wodorowęglanów wykazali Pettersson i Cohen.

Badania Petterssona dotyczyły metabolizmu glukozy i kwasów tłuszczowych przez nerki podczas 6-dniowego hipotermicznego przechowywania perfuzji i odkrył, że nerki konsumują glukozę w ilości 4,4 μmol / g / dzień i kwasy tłuszczowe w ilości 5,8 μmol / g / dzień. W badaniu Cohena najlepsze nerki przechowywane przez 8 dni spożywały glukozę odpowiednio z szybkością 2,3 μmol / g / dzień i 4,9 μmol / g / dzień, co wskazywało na prawdopodobieństwo, że używają kwasów tłuszczowych w podobnym tempie jak nerki psów Petterssona. Stałość zarówno szybkości zużycia glukozy, jak i tempa produkcji wodorowęglanów sugerowała, że ​​żadne uszkodzenie nie wpływało na układ enzymów glikolitycznych lub anhydrazy węglanowej.

Lee wykazał, że kwasy tłuszczowe były preferowanym substratem kory nerkowej królika w temperaturach normotermicznych, a glukoza preferowanym substratem dla komórek rdzeniowych, które normalnie metabolizują beztlenowo. Abodeely wykazał, że zarówno kwasy tłuszczowe, jak i glukoza mogą być wykorzystywane przez zewnętrzny rdzeń nerki królika, ale glukoza była wykorzystywana preferencyjnie. W hipotermii potrzeby metaboliczne nerek są znacznie zmniejszone, ale występuje mierzalne zużycie glukozy, kwasów tłuszczowych i ciał ketonowych. Horsburgh wykazał, że lipidy są wykorzystywane przez hipotermiczne nerki, przy czym spożycie palmitynianu w korze nerki szczura w temperaturze 15 ° C wynosi 0-15% normy. Pettersson wykazał, że na podstawie molowej glukoza i kwasy tłuszczowe były metabolizowane przez hipotermicznie perfundowane nerki z mniej więcej taką samą szybkością. Huang wykazał, że kora nerki psa w hipotermii traci lipidy (35% utrata całkowitego lipidu po 24 godzinach), chyba że do perfuzatu nerki dodano oleinian. Huang skomentował, że ta utrata może wpłynąć na strukturę komórki i że utrata ta sugeruje również, że nerka zużywa kwas tłuszczowy. W późniejszej publikacji Huang wykazał, że plastry kory nerki psa metabolizują kwasy tłuszczowe, ale nie glukozę, w temperaturze 10 ° C.

Nawet jeśli zapewnione zostaną odpowiednie składniki odżywcze, mogą one zostać utracone w wyniku wchłonięcia do przewodów systemu konserwującego. Lee wykazał, że kauczuk silikonowy (materiał szeroko stosowany w systemach ochrony nerek) wchłania 46% kwasu oleinowego perfuzatu po 4 godzinach perfuzji.

Nagromadzenie toksyn

Abouna wykazał, że amoniak był uwalniany do perfuzatu podczas 3-dniowego przechowywania w nerkach i zasugerował, że może być toksyczny dla komórek nerkowych, chyba że zostanie usunięty przez częstą wymianę perfuzatu. Pewnego wsparcia dla stosowania wymiany perfuzatu podczas długich perfuzji zapewnił Liu, który użył wymiany perfuzatu w swoich udanych 7-dniowych eksperymentach z przechowywaniem. Grundmann stwierdził również, że jakość konserwacji przez 96 godzin poprawiła się dzięki zastosowaniu podwójnej objętości perfuzatu lub wymianie perfuzatu. Jednak wnioski Grundmanna oparto na porównaniach z grupą kontrolną składającą się tylko z 3 psów. Cohen nie był w stanie wykazać żadnej produkcji amoniaku podczas 8 dni perfuzji i żadnych korzyści z wymiany perfuzatu; wykazano, że postępująca zasadowość, która wystąpiła podczas perfuzji, była spowodowana produkcją wodorowęglanów.

Toksyczne uszkodzenie przez perfuzat

Wykazano, że niektóre perfuzaty mają toksyczny wpływ na nerki w wyniku nieumyślnego włączenia określonych substancji chemicznych do ich składu. Collins wykazał, że prokaina zawarta w składzie jego płynów do przepłukiwania może być toksyczna, a Pegg skomentował, jak toksyczne materiały, takie jak plastyfikatory PVC, mogą być wypłukiwane z przewodów obwodu perfuzyjnego. Dvorak wykazał, że dodatek metyloprednizolonu do perfuzatu, który Woods uważał za niezbędny, może w pewnych okolicznościach być szkodliwy. Wykazał, że przy ponad g metylo-prednizolonu w 650 ml perfuzatu (w porównaniu z 250 mg w 1 litrze stosowanym przez Woodsa) nieodwracalne zmiany hemodynamiczne i strukturalne powstały w nerkach po 20 godzinach perfuzji. Wystąpiła martwica pętli włośniczkowych, zamknięcie przestrzeni Bowmana, pogrubienie błony podstawnej i uszkodzenie komórek śródbłonka.

Zmywanie niezbędnych podłoży

Warnick uważał, że poziom nukleotydów pozostających w komórce po przechowywaniu jest istotny przy określaniu, czy komórka będzie zdolna do ponownej syntezy ATP i regeneracji po ogrzaniu. Częsta zmiana perfuzatu lub stosowanie dużej objętości perfuzatu ma teoretyczną wadę polegającą na tym, że rozbite nukleotydy adeninowe mogą być wypłukiwane z komórek i dlatego nie mogą być ponownie syntezowane do ATP po ogrzaniu nerki.

Uraz jądrowego DNA

Jądrowe DNA zostaje uszkodzone podczas przechowywania nerek w chłodzie. Lazarus wykazał, że w nerkach myszy przechowywanych w hipotermii doszło do pęknięć jednoniciowego DNA w ciągu 16 godzin, a uszkodzenie zostało nieco zahamowane przez przechowywanie w roztworach Collinsa lub Sacksa. To uszkodzenie jądra różniło się od tego obserwowanego w ciepłym uszkodzeniu, gdy nastąpiły pęknięcia dwuniciowego DNA.

Mechaniczne uszkodzenie układu naczyniowego

Metody przechowywania perfuzji mogą spowodować mechaniczne uszkodzenie śródbłonka naczyniowego nerki, co po ponownej implantacji prowadzi do zakrzepicy tętniczej lub odkładania się fibryny. Hill zauważył, że w ludzkich nerkach odkładanie się fibryny w kłębuszkach po reimplantacji i czynności pooperacyjnej jest skorelowane z długością przechowywania perfuzji. Podczas rewaskularyzacji pobrał biopsje z ludzkich nerek zakonserwowanych przez perfuzję lub przechowywanie w lodzie i wykazał pod mikroskopem elektronowym, że uszkodzenie śródbłonka wystąpiło tylko w tych nerkach, które były perfundowane. Biopsje wykonane godzinę po rewaskularyzacji wykazały, że płytki krwi i fibryna przylegają do wszelkich obszarów odsłoniętej naczyniowej błony podstawnej. Sheil opisał inny rodzaj uszkodzenia naczyń, który wykazał, jak może dojść do zmiany strumienia dystalnie od kaniuli przyłączonej do tętnicy nerkowej, co prowadzi do zakrzepicy tętniczej w odległości około 1 cm od miejsca kaniuli.

Uraz po reimplantacji

Istnieją dowody na to, że mechanizmy immunologiczne mogą uszkodzić nerki perfundowane hipotermicznie po ponownej implantacji, jeśli perfuzat zawiera specyficzne przeciwciała. Cross opisał dwie pary nerek ze zwłok ludzkich, które były perfundowane jednocześnie krioprecypitowanym osoczem zawierającym specyficzne dla typu przeciwciało HLA przeciwko jednej z par. Obie te nerki cierpiały na wczesną zakrzepicę tętniczą. Light opisał podobne hiperostre odrzucenie po przechowywaniu perfuzji i wykazał, że zastosowane krioprecypitowane osocze zawierało cytotoksyczne przeciwciało IgM. To potencjalne niebezpieczeństwo stosowania osocza poddanego krioprecypitacji zostało wykazane eksperymentalnie przez Filo, który perfundował psie nerki przez 24 godziny specjalnie uczulonym krioprecypitowanym osoczem psa i odkrył, że może wywoływać zmiany kłębuszkowe i naczyniowe z obrzękiem naczyń włosowatych, obrzękiem śródbłonka, infiltracją przez leukocyty polimorfojądrowe i zakrzepicą tętniczą. Mikroskopia immunofluorescencyjna wykazała specyficzne wiązanie IgG wzdłuż powierzchni śródbłonka, w kłębuszkach, a także w naczyniach. Po reimplantacji wiązanie dopełniacza i uszkodzenie tkanki wystąpiły w podobny sposób. Wystąpiła korelacja między ciężkością uszkodzenia histologicznego a późniejszą czynnością nerek.

Wielu pracowników próbowało zapobiegać nagrzewaniu się nerek podczas ponownej implantacji, ale tylko Cohen opisał stosowanie systemu aktywnego chłodzenia. Pomiary uwalniania enzymów lizosomalnych przez nerki poddane pozorowanym zespoleniom, zarówno w układzie chłodzenia, jak i poza nim, wykazały, jak wrażliwe są nerki na rozgrzanie po okresie przechowywania w chłodni i potwierdziły skuteczność układu chłodzenia w zapobieganiu uwalnianiu enzymów. Kolejnym czynnikiem minimalizującym obrażenia podczas operacji reimplantacji mogło być to, że nerki były utrzymywane w temperaturze 7 ° C w wężownicy chłodzącej, która mieściła się w zakresie temperatury stosowanej podczas przechowywania perfuzji, tak że nerki nie były poddawane działaniu większego zmiany temperatury, które wystąpiłyby, gdyby zastosowano chłodzenie lodem.

Dempster opisał powolne zwalnianie zacisków naczyniowych pod koniec operacji reimplantacji nerki, aby uniknąć uszkodzenia nerki, ale inni pracownicy nie wspominali, czy stosowali ten manewr, czy też nie. Po tym, jak Cohen wykrył uszkodzenie naczyń krwionośnych z krwawieniem wewnątrz nerkowym po 3 dniach przechowywania perfuzji, we wszystkich kolejnych eksperymentach zastosowano technikę powolnej rewaskularyzacji, aby dać naczyniom wewnątrznerkowym czas na odzyskanie ich napięcia na tyle, aby zapobiec wystąpieniu pełnego ciśnienia skurczowego. nakładany na kruche naczynia kłębuszkowe. Brak poważnego uszkodzenia naczyń w jego późniejszych perfuzjach można przypisać zastosowaniu tego manewru.

Bibliografia