Północna plama - Northern blot
Northern blot lub RNA blot jest techniką stosowaną w biologii molekularnej badań W celu zbadania ekspresji genu przez wykrywanie RNA (lub samodzielnie mRNA ) w próbkach.
Za pomocą techniki Northern blotting można zaobserwować komórkową kontrolę nad strukturą i funkcją poprzez określenie szybkości ekspresji poszczególnych genów podczas różnicowania i morfogenezy , jak również w warunkach nieprawidłowych lub chorobowych. Northern blot obejmuje zastosowanie elektroforezy do rozdzielenia próbek RNA według wielkości i detekcję sondą hybrydyzacyjną komplementarną do części lub całej sekwencji docelowej. Termin „northern blot” w rzeczywistości odnosi się konkretnie do przenoszenia kapilarnego RNA z żelu do elektroforezy na membranę do blottingu. Jednak cały proces jest powszechnie określany jako Northern blotting. Technika Northern blot została opracowana w 1977 roku przez Jamesa Alwine'a, Davida Kempa i George'a Starka na Uniwersytecie Stanforda . Northern blotting bierze swoją nazwę od podobieństwa do pierwszej techniki blottingu, Southern blot , nazwanej na cześć biologa Edwina Southerna . Główna różnica polega na tym, że metodą Northern blot analizuje się RNA, a nie DNA .
Procedura
Ogólna procedura blottingu rozpoczyna się od ekstrakcji całkowitego RNA z próbki homogenizowanej tkanki lub komórek. Eukariotyczne mRNA można następnie wyizolować za pomocą chromatografii na oligo (dT) celulozie, aby wyizolować tylko te RNA z ogonem poli(A) . Próbki RNA są następnie rozdzielane przez elektroforezę żelową. Ponieważ żele są kruche, a sondy nie są w stanie wejść do matrycy, próbki RNA, teraz rozdzielone wielkością, są przenoszone na nylonową membranę przez system kapilarny lub próżniowy.
Membrana nylonowa z ładunkiem dodatnim jest najbardziej efektywna do zastosowania w Northern blotting, ponieważ ujemnie naładowane kwasy nukleinowe mają do nich wysokie powinowactwo. Bufor transferowy stosowany do blottingu zazwyczaj zawiera formamid, ponieważ obniża on temperaturę hybrydyzacji oddziaływania sonda-RNA, eliminując w ten sposób potrzebę wysokich temperatur, które mogłyby powodować degradację RNA. Po przeniesieniu RNA na błonę jest on unieruchamiany przez kowalencyjne połączenie z błoną za pomocą światła UV lub ciepła. Po oznakowaniu sonda jest hybrydyzowana z RNA na błonie. Warunki doświadczalne, które mogą wpływać na wydajność i specyficzność hybrydyzacji, obejmują siłę jonową, lepkość, długość dupleksu, niedopasowane pary zasad i skład zasad. Membranę przemywa się, aby upewnić się, że sonda związała się specyficznie i aby zapobiec powstawaniu sygnałów tła. Sygnały hybrydowe są następnie wykrywane przez kliszę rentgenowską i mogą być określane ilościowo za pomocą densytometrii . W celu stworzenia kontroli do porównania w analizie Northern blot, próbki niewykazujące produktu genu będącego przedmiotem zainteresowania mogą być użyte po oznaczeniu za pomocą mikromacierzy lub RT-PCR .
Żele
Próbki RNA są najczęściej rozdzielane na żelach agarozowych zawierających formaldehyd jako czynnik denaturujący RNA w celu ograniczenia struktury drugorzędowej. Żele można wybarwić bromkiem etydyny (EtBr) i obejrzeć w świetle UV w celu zaobserwowania jakości i ilości RNA przed blottingiem. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z mocznikiem może być również stosowana do rozdzielania RNA, ale jest najczęściej stosowana do pofragmentowanego RNA lub mikroRNA. Drabinka RNA często przebiega obok próbek na żelu do elektroforezy, aby obserwować wielkość uzyskanych fragmentów, ale w próbkach całkowitego RNA podjednostki rybosomalne mogą działać jako markery wielkości. Ponieważ duża podjednostka rybosomalna to 28S (około 5 kb), a mała podjednostka rybosomalna to 18S (około 2 kb), na żelu pojawiają się dwa wyraźne prążki, większe z prawie dwukrotnie większą intensywnością niż mniejsze.
Sondy
Sondy do metody Northern blotting składają się z kwasów nukleinowych z sekwencją komplementarną do całości lub części RNA będącego przedmiotem zainteresowania, mogą to być DNA, RNA lub oligonukleotydy z co najmniej 25 zasadami komplementarnymi do sekwencji docelowej. Sondy RNA (rybosondy), które są transkrybowane in vitro, są w stanie wytrzymać bardziej rygorystyczne etapy płukania, zapobiegając niektórym szumom tła. Zwykle cDNA jest tworzone ze znakowanymi starterami dla interesującej sekwencji RNA, które działają jako sonda w analizie Northern blot. Sondy muszą być oznaczane z izotopami promieniotwórczymi ( 32 P) lub chemiluminescencję w którym fosfataza alkaliczna lub peroksydaza chrzanowa (HRP) rozkładają substratów chemiluminescencyjne dać wykrywalny emisji światła. Znakowanie chemiluminescencyjne może zachodzić na dwa sposoby: albo sonda jest przyłączona do enzymu, albo sonda jest znakowana ligandem (np. biotyna ), dla którego ligand (np. awidyna lub streptawidyna ) jest przyłączony do enzymu (np. HRP) . Film rentgenowski może wykryć zarówno sygnały radioaktywne, jak i chemiluminescencyjne, a wielu badaczy preferuje sygnały chemiluminescencyjne, ponieważ są one szybsze, bardziej czułe i zmniejszają zagrożenia dla zdrowia, które towarzyszą etykietom radioaktywnym. Tę samą błonę można sondować do pięciu razy bez znaczącej utraty docelowego RNA.
Aplikacje
Northern blotting pozwala zaobserwować wzorzec ekspresji konkretnego genu między tkankami, narządami, stadiami rozwojowymi, poziomami stresu środowiskowego, zakażeniem patogenem iw trakcie leczenia. Technika ta została wykorzystana do wykazania nadekspresji onkogenów i regulacji w dół genów supresorowych nowotworów w komórkach nowotworowych w porównaniu z „normalną” tkanką, a także ekspresji genów w odrzuceniu przeszczepionych narządów. Jeśli podwyższony gen jest obserwowany przez obfitość mRNA w Northern blot, próbkę można następnie zsekwencjonować w celu ustalenia, czy gen jest znany naukowcom, czy jest to nowe odkrycie. Wzory ekspresji uzyskane w danych warunkach mogą zapewnić wgląd w funkcję tego genu. Ponieważ RNA jest najpierw rozdzielany według rozmiaru, jeśli stosuje się tylko jeden typ sondy, wariancja poziomu każdego prążka na błonie może zapewnić wgląd w rozmiar produktu, sugerując alternatywne produkty składania tego samego genu lub motywy sekwencji powtarzalnej. Różnice w wielkości produktu genu mogą również wskazywać na delecje lub błędy w przetwarzaniu transkryptu. Zmieniając docelową sondę stosowaną wzdłuż znanej sekwencji, można określić, którego regionu RNA brakuje.
Zalety i wady
Analizę ekspresji genów można przeprowadzić kilkoma różnymi metodami, w tym RT-PCR, testami ochrony przed RNazą, mikromacierzami, RNA-Seq , seryjną analizą ekspresji genów (SAGE), jak również metodą Northern blotting. Mikromacierze są dość powszechnie używane i zwykle są zgodne z danymi uzyskanymi z Northern blot; jednak czasami Northern blotting jest w stanie wykryć niewielkie zmiany w ekspresji genów, których nie potrafią mikromacierze. Zaletą mikromacierzy nad Northern blot jest to, że jednocześnie można wizualizować tysiące genów, podczas gdy Northern blot zwykle dotyczy jednego lub niewielkiej liczby genów.
Problemem w Northern blotting jest często rozkład próbki przez RNazy (zarówno endogenne dla próbki, jak i przez zanieczyszczenie środowiska), którego można uniknąć przez odpowiednią sterylizację naczyń szklanych i zastosowanie inhibitorów RNaz, takich jak DEPC ( dietylopirowęglan ). Substancje chemiczne stosowane w większości Northern blot mogą stanowić zagrożenie dla badacza, ponieważ formaldehyd, materiał radioaktywny, bromek etydyny, DEPC i światło UV są szkodliwe pod pewnymi ekspozycjami. W porównaniu z RT-PCR, Northern blotting ma niską czułość, ale ma również wysoką specyficzność, co jest ważne dla zmniejszenia wyników fałszywie dodatnich.
Zalety stosowania Northern blotting obejmują wykrywanie wielkości RNA, obserwację produktów alternatywnego splicingu, użycie sond o częściowej homologii, jakość i ilość RNA można zmierzyć na żelu przed blottingiem, a membrany można przechowywać i ponownie sondowany przez lata po osuszeniu.
W przypadku techniki Northern blot do wykrywania mRNA acetylocholinesterazy technikę nieradioaktywną porównano z techniką radioaktywną i stwierdzono, że jest równie czuła jak technika radioaktywna, ale nie wymaga ochrony przed promieniowaniem i jest mniej czasochłonna.
Odwrócona plama północna
Naukowcy od czasu do czasu stosują wariant procedury znany jako odwrócona plama północna. W tej procedurze substrat kwasu nukleinowego (który jest przymocowany do błony) jest zbiorem wyizolowanych fragmentów DNA, a sondą jest RNA wyekstrahowany z tkanki i znakowany radioaktywnie. Zastosowanie mikromacierzy DNA , które weszły do powszechnego użytku pod koniec lat 90. i na początku 2000 r., jest bardziej zbliżone do procedury odwrotnej, ponieważ obejmuje użycie izolowanych fragmentów DNA przymocowanych do podłoża i hybrydyzację z sondą wykonaną z komórkowego RNA . Tak więc odwrotna procedura, choć początkowo nieczęsta, umożliwiła analizę Northern przekształcenie się w profilowanie ekspresji genów , w którym wiele (prawdopodobnie wszystkie) genów w organizmie może być monitorowanych.
Zobacz też
- Zachodnia plama
- wschodnia plama
- Północno-zachodnia plama
- Dalekowschodnia plama
- Dalekozachodnia plama
- Wyświetlacz różnicowy
Bibliografia
Zewnętrzne linki
|
Zasoby biblioteczne o Northern blot |