Podwiązanie (biologia molekularna) - Ligation (molecular biology)
W biologii molekularnej , ligacja jest łączenie dwóch fragmentów kwasów nukleinowych przez działanie enzymem. Jest to niezbędna procedura laboratoryjna w klonowaniu molekularnym DNA, w której fragmenty DNA są łączone w celu utworzenia rekombinowanych cząsteczek DNA , na przykład gdy obcy fragment DNA jest wstawiany do plazmidu . Końce fragmentów DNA są łączone przez tworzenie wiązań fosfodiestrowych między 3'-hydroksylem jednego końca DNA z 5'-fosforylem drugiego. Podobnie można ligować RNA. Kofaktor jest na ogół zaangażowany w reakcję i jest to zwykle ATP lub NAD + .
W laboratorium ligację zwykle wykonuje się przy użyciu ligazy DNA T4 , jednak popularne są również procedury ligacji bez użycia standardowej ligazy DNA.
Reakcja ligacyjna
Mechanizm reakcji ligacji został po raz pierwszy wyjaśniony w laboratorium I. Roberta Lehmana. Dwa fragmenty DNA mogą być połączone razem przez ligazę DNA, która katalizuje tworzenie wiązania fosfodiestrowego między 3'-OH na jednym końcu nici DNA i grupą 5'-fosforanową drugiego. W badaniach na zwierzętach i bakteriofagów , ATP, stosuje się jako źródło energii do ligacji, podczas gdy w komórkach bakterii, NAD + jest używany.
Ligaza DNA najpierw reaguje z ATP lub NAD + , tworząc związek pośredni ligaza-AMP z AMP połączonym z grupą ε-aminową lizyny w miejscu aktywnym ligazy poprzez wiązanie fosfoamidowe. Ta grupa adenylylowa jest następnie przenoszona do grupy fosforanowej na końcu 5' łańcucha DNA, tworząc kompleks DNA-adenylan. Wreszcie, wiązanie fosfodiestrowe między dwoma końcami DNA jest tworzone przez atak nukleofilowy 3'-hydroksylu na końcu nici DNA na aktywowaną grupę 5'-fosforylową innego.
Nick w DNA (tj przerwy w jednej nici dwuniciowego DNA) może być naprawione bardzo skutecznie przez ligazy. Jednak komplikująca cecha ligacji pojawia się podczas ligacji dwóch oddzielnych końców DNA, ponieważ oba końce muszą się połączyć, zanim reakcja ligacji będzie mogła zachodzić. W przypadku ligacji DNA z lepkimi lub spoistymi końcami , wystające nici DNA mogą być już połączone ze sobą, dlatego jest to stosunkowo wydajny proces, ponieważ jest równoważny naprawie dwóch nacięć w DNA. Jednak w przypadku ligowania tępych końców , które nie mają wystających końców, aby DNA mogło się ze sobą łączyć, proces jest zależny od przypadkowej kolizji, aby końce zrównały się ze sobą, zanim będą mogły zostać zligowane, i w konsekwencji jest procesem znacznie mniej wydajnym. Ligaza DNA z E. coli nie może ligować DNA o tępych końcach, z wyjątkiem warunków stłoczenia molekularnego i dlatego nie jest zwykle używana do ligacji w laboratorium. Zamiast tego stosuje się ligazę DNA z faga T4, ponieważ może ona ligować DNA o tępych końcach, jak również jednoniciowy DNA.
Czynniki wpływające na podwiązanie
Czynniki, które wpływają na reakcję chemiczną, w której pośredniczy enzym, w naturalny sposób wpływają na reakcję ligacji, takie jak stężenie enzymu i reagentów, jak również temperatura reakcji i długość czasu inkubacji. Ligacja jest skomplikowana przez fakt, że pożądane produkty ligacji dla większości reakcji ligacji powinny znajdować się między dwiema różnymi cząsteczkami DNA, a reakcja obejmuje zarówno reakcje między-, jak i wewnątrzcząsteczkowe, oraz że dla wydajnej ligacji konieczny jest dodatkowy etap przyłączania.
Trzy etapy tworzenia nowego wiązania fosfodiestrowego podczas ligacji to: adenylacja enzymu, przeniesienie adenylu do DNA i uszczelnianie nacięć. Mg(2+) jest kofaktorem katalizy, dlatego przy wysokim stężeniu Mg(2+) skuteczność ligacji jest wysoka. Jeśli stężenie Mg(2+) jest ograniczone, nacięcie jest reakcją ograniczającą szybkość procesu, a adenylowany produkt pośredni DNA pozostaje w roztworze. Taka adenylacja enzymu hamuje ponowne wiązanie do pośredniego adenylowanego DNA, porównanie pięty achillesowej LIG1 i stanowi ryzyko, jeśli nie są one utrwalone.
Stężenie DNA
Stężenie DNA może wpływać na szybkość ligacji oraz na to, czy ligacja jest reakcją międzycząsteczkową czy wewnątrzcząsteczkową. Ligacja polega na łączeniu końców DNA z innymi końcami, jednak każdy fragment DNA ma dwa końce, a jeśli końce są kompatybilne, cząsteczka DNA może cyrkulować, łącząc swoje własne końce. Przy wysokim stężeniu DNA istnieje większa szansa, że jeden koniec cząsteczki DNA zetknie się z końcem innego DNA, tworząc w ten sposób ligację międzycząsteczkową. Przy niższym stężeniu DNA zwiększa się prawdopodobieństwo, że jeden koniec cząsteczki DNA zetknie się z drugim końcem tej samej cząsteczki, dlatego bardziej prawdopodobna jest reakcja wewnątrzcząsteczkowa, która powoduje cyrkulację DNA. Wydajność transformacji liniowego DNA jest również znacznie niższa niż kolistego DNA, a aby DNA mógł się cyrkulować, stężenie DNA nie powinno być zbyt wysokie. Zgodnie z ogólną zasadą, całkowite stężenie DNA powinno być mniejsze niż 10 μg/ml.
Względne stężenie fragmentów DNA, ich długość, a także warunki buforowania są również czynnikami, które mogą wpływać na to, czy preferowane są reakcje międzycząsteczkowe czy wewnątrzcząsteczkowe.
Stężenie DNA można sztucznie zwiększyć, dodając środki kondensujące, takie jak heksamina kobaltu i biogenne poliaminy, takie jak spermidyna , lub stosując środki zagęszczające, takie jak glikol polietylenowy (PEG), które również zwiększają skuteczne stężenie enzymów. Należy jednak zauważyć, że dodatki, takie jak heksamina kobaltu, mogą powodować wyłącznie reakcję międzycząsteczkową, powodując raczej liniowe konkatemery niż kolisty DNA, bardziej odpowiedni do transformacji plazmidowego DNA, a zatem jest niepożądany do ligacji plazmidu. Jeśli konieczne jest użycie dodatków w ligacji plazmidów, korzystne jest użycie PEG, ponieważ może on sprzyjać ligacji wewnątrzcząsteczkowej, jak i międzycząsteczkowej.
Stężenie ligazy
Im wyższe stężenie ligazy, tym szybsze tempo ligacji. Ligacja z tępymi końcami jest znacznie mniej skuteczna niż ligacja z lepkimi końcami, więc w ligacjach na tępe końce stosuje się wyższe stężenie ligazy. Wysokie stężenie ligazy DNA można stosować w połączeniu z PEG w celu szybszej ligacji i są to składniki często spotykane w komercyjnych zestawach przeznaczonych do szybkiej ligacji.
Temperatura
Rozważając temperaturę reakcji ligacji, wiążą się dwie kwestie. Po pierwsze, optymalna temperatura dla DNA ligazy, aktywność, która wynosi 37 ° C, a po drugie, temperatura topnienia (T m ) końców DNA, które mają być połączone. Temperatura topnienia zależy od długości i składu zasad nawisu DNA — im większa liczba G i C, tym wyższa T m, ponieważ istnieją trzy wiązania wodorowe utworzone między parą zasad GC w porównaniu z dwoma dla pary zasad AT — z pewnymi wkład z układania podstaw między fragmentami. Dla reakcji ligacji przebiegać wydajnie końce powinny być trwale wyżarzaniu, a w doświadczeniach na ligacji, T m końców DNA jest znacznie niższa niż 37 ° C Temperatura optymalne dla ligację lepkich końców jest zatem kompromis między najlepszym temperatura DNA ligazy, aktywność i T m , w którym końce mogą skojarzyć. Jednak różne enzymy restrykcyjne wytwarzają różne końce, a podstawowy skład końców wytwarzanych przez te enzymy może się również różnić, temperatura topnienia, a zatem optymalna temperatura może się znacznie różnić w zależności od użytych enzymów restrykcyjnych, a optymalna temperatura ligacji może być między 4-15 ° C w zależności od końcówek. Ligacje często obejmują również ligację końcówek wytworzonych z różnych enzymów restrykcyjnych w tej samej mieszaninie reakcyjnej, dlatego wybór optymalnej temperatury dla konkretnej reakcji ligacji może nie być praktyczny, a większość protokołów po prostu wybiera 12-16 ° C, temperaturę pokojową lub 4 ° C .
Skład buforowy
Siła jonowa użytego buforu może wpływać na ligację. Rodzaje obecności kationów mogą również wpływać na reakcję ligacji, na przykład nadmierna ilość Na + może spowodować, że DNA stanie się sztywniejsze i zwiększy prawdopodobieństwo ligacji międzycząsteczkowej. Przy wysokim stężeniu kationu jednowartościowego (>200 mM) ligacja może być również prawie całkowicie zahamowana. Standardowy bufor używany do ligacji ma na celu zminimalizowanie efektów jonowych.
Podwiązanie lepkich końcówek
Enzymy restrykcyjne mogą generować wiele różnych końców w trawionym DNA, ale w eksperymentach klonowania najczęściej stosowane enzymy restrykcyjne generują 4-zasadowy jednoniciowy nawis zwany lepkim lub kohezyjnym końcem (wyjątki obejmują Nde I, który generuje 2- zwis podstawy i te, które generują tępe końce). Te lepkie końce mogą wygrzewać się z innymi kompatybilnymi końcami i zostać podwiązane w ligacji z lepkim końcem (lub kohezyjnym końcem). Eco RI na przykład generuje koniec AAtt i od A i T mają temperaturę topnienia niższą niż C i G, jego temperaturę topnienia, T m jest niska, około 6 ° C W większości enzymów restrykcyjnych wystające wytwarzane posiadają T m , który jest około 15 ° C. Ze względów praktycznych ligacje z lepkimi końcami przeprowadza się w temperaturze 12-16 ° C lub w temperaturze pokojowej, lub alternatywnie w 4 ° C przez dłuższy okres.
W celu wstawienia fragmentu DNA do wektora plazmidowego, korzystne jest użycie dwóch różnych enzymów restrykcyjnych do trawienia DNA tak, aby powstały różne końce. Dwa różne końce mogą zapobiec ponownej ligacji wektora bez żadnej wstawki, a także umożliwiają wstawienie fragmentu w sposób kierunkowy.
Gdy nie jest możliwe użycie dwóch różnych miejsc, może zaistnieć potrzeba defosforylacji wektora DNA, aby uniknąć wysokiego tła recyrkularyzowanego wektora DNA bez wstawki. Bez grupy fosforanowej na końcach wektor nie może ligować ze sobą, ale może być zligowany do wstawki z grupą fosforanową. Defosforylacja jest powszechnie wykonywana za pomocą alkalicznej fosfatazy jelitowej cielęcia (CIAP), która usuwa grupę fosforanową z końca 5' strawionego DNA, ale należy pamiętać, że CIAP nie jest łatwy do inaktywacji i może zakłócać ligację bez dodatkowego etapu usuwania CIAP, co skutkuje niepowodzeniem podwiązania. CIAP nie powinien być stosowany w nadmiernych ilościach i powinien być stosowany tylko wtedy, gdy jest to konieczne. Alkaliczna fosfataza krewetkowa (SAP) lub fosfataza antarktyczna (AP) są odpowiednią alternatywą, ponieważ można je łatwo dezaktywować.
Podwiązanie tępe
Podwiązanie tępych końców nie obejmuje parowania podstaw wystających końców, więc każdy tępy koniec może być podwiązany z innym tępym końcem. Tępe końce mogą być generowane przez enzymy restrykcyjne, takie jak Sma I i Eco RV . Główną zaletą klonowania tępych końców jest to, że pożądana wstawka nie wymaga żadnych miejsc restrykcyjnych w swojej sekwencji, ponieważ tępe końce są zwykle generowane w reakcji PCR , a wytworzony w reakcji PCR fragment DNA o tępych końcach może być następnie zligowany do wektor końcowy wytworzony z trawienia restrykcyjnego.
Jednak ligacja tępych końców jest znacznie mniej wydajna niż ligacja z lepkimi końcami, zwykle reakcja jest 100 razy wolniejsza niż ligacja z lepkimi końcami. Ponieważ tępe końce nie mają wystających końców, reakcja ligacji zależy od przypadkowych kolizji między tępymi końcami i w konsekwencji jest znacznie mniej wydajna. Aby zrekompensować niższą wydajność, stosowane stężenie ligazy jest wyższe niż ligacja z lepkim końcem (10x lub więcej). Stężenie DNA stosowane w ligacji tępych końców jest również wyższe, aby zwiększyć prawdopodobieństwo kolizji między końcami, a dłuższy czas inkubacji może być również stosowany do ligacji tępych końców.
Jeśli oba końce, które mają być zligowane z wektorem, mają tępe końce, wektor musi być defosforylowany, aby zminimalizować samoligację. Można to zrobić za pomocą CIAP, ale należy zachować ostrożność w jego stosowaniu, jak wspomniano wcześniej. Ponieważ wektor został zdefosforylowany, a ligacja wymaga obecności 5'-fosforanu, wstawka musi być fosforylowana. Produkt PCR z tępymi końcami zwykle nie zawiera 5'-fosforanu, dlatego musi być ufosforylowany przez działanie kinazą polinukleotydową T4 .
Podwiązanie tępych końców jest również odwracalnie hamowane przez wysokie stężenie ATP.
PCR zazwyczaj generuje produkty PCR o tępych końcach , ale należy zauważyć, że PCR z użyciem polimerazy Taq może dodać dodatkową adeninę (A) do końca 3' produktu PCR. Ta właściwość może być wykorzystana w klonowaniu TA, gdzie końce produktu PCR mogą hybrydyzować z końcem T wektora. Podwiązanie TA jest zatem formą podwiązywania końcówek samoprzylepnych. Wektory z tępymi końcami można przekształcić w wektor do ligacji TA z trifosforanem dideoksytymidyny (ddTTP) przy użyciu transferazy terminalnej.
Ogólne wytyczne
Do klonowania wstawki do okrągłego plazmidu:
- Całkowite stosowane stężenie DNA powinno być mniejsze niż 10 μg/ml, ponieważ plazmid wymaga recyrkulacji.
- Stosunek molowy wstawki do wektora jest zwykle stosowany przy około 3:1. Bardzo wysoki stosunek może powodować wiele wkładek. Proporcje można regulować w zależności od rozmiaru wkładki i można stosować inne proporcje, takie jak 1:1.
Rozwiązywanie problemów
Czasami ligacja nie daje pożądanych produktów ligowanych, a niektóre z możliwych przyczyn mogą być następujące:
- Uszkodzone DNA – Nadmierna ekspozycja na promieniowanie UV podczas przygotowywania DNA do ligacji może uszkodzić DNA i znacznie zmniejszyć wydajność transformacji . Promieniowanie UV o większej długości fali (365 nm), które powoduje mniejsze uszkodzenia DNA, powinno być stosowane, jeśli jest to konieczne do pracy nad DNA na transiluminatorze UV przez dłuższy czas. Dodanie cytydyny lub guanozyny do buforu do elektroforezy w stężeniu 1 mM może jednak chronić DNA przed uszkodzeniem.
- Nieprawidłowe użycie CIAP lub jego nieskuteczna dezaktywacja lub usunięcie.
- Użyto nadmiernej ilości DNA.
- Niekompletne trawienie DNA – wektor DNA, który jest niecałkowicie strawiony, spowoduje powstanie wysokiego tła, co można sprawdzić wykonując ligację bez wstawki jako kontrolę. Wkład, który nie jest całkowicie strawiony, również nie będzie prawidłowo podwiązywany i krąży. Podczas trawienia produktu PCR, upewnij się, że do końca 5' oligonukleotydów użytych do PCR dodano wystarczającą ilość dodatkowych zasad, ponieważ wiele enzymów restrykcyjnych wymaga minimalnej liczby dodatkowych par zasad do skutecznego trawienia. Informacje o minimalnej wymaganej parze zasad są dostępne u dostawców enzymów restrykcyjnych, takich jak katalog New England Biolabs .
- Niekompletna ligacja – DNA o tępych końcach (np. Sma I ) i niektóre DNA z lepkimi końcami (np. Nde I ), które mają niską temperaturę topnienia, wymagają więcej ligazy i dłuższego czasu inkubacji.
- Białko eksprymowane ze zligowanej wstawki genu jest toksyczne dla komórek.
- Homologiczna sekwencja we wstawce do sekwencji w plazmidowym DNA skutkująca delecją.
Inne metody ligacji DNA
Wiele dostępnych na rynku zestawów do klonowania DNA wykorzystuje inne metody ligacji, które nie wymagają użycia zwykłych ligaz DNA. Metody te umożliwiają znacznie szybsze klonowanie, a także pozwalają na prostsze przeniesienie sklonowanej wstawki DNA do różnych wektorów . Metody te wymagają jednak użycia specjalnie zaprojektowanych wektorów i komponentów i mogą nie być elastyczne.
Ligacja za pośrednictwem topoizomerazy
Do ligacji można zastosować topoizomerazę zamiast ligazy, a klonowanie można przeprowadzić szybciej bez potrzeby trawienia restrykcyjnego wektora lub wstawki. W tej metodzie klonowania TOPO linearyzowany wektor jest aktywowany przez przyłączenie topoizomerazy I do jego końców, a ten wektor „aktywowany TOPO” może następnie zaakceptować produkt PCR przez ligację z obydwoma końcami 5' produktu PCR, topoizomeraza jest uwalniana a w procesie powstaje wektor kołowy.
Rekombinacja homologiczna
Inną metodą klonowania bez użycia ligazy jest rekombinacja DNA , na przykład stosowana w systemie klonowania Gateway . Gen, raz sklonowany do wektora do klonowania (nazywanego w tej metodzie klonem wejściowym), może być dogodnie wprowadzony do różnych wektorów ekspresyjnych przez rekombinację.