Chromatografii powinowactwa - Affinity chromatography

Chromatografia powinowactwa to metoda oddzielania biocząsteczki z mieszaniny, oparta na wysoce specyficznej interakcji wiązania makrocząsteczkowego między biocząsteczką a inną substancją. Specyficzny rodzaj interakcji wiązania zależy od interesującej nas biocząsteczki; Interakcje wiążące antygen i przeciwciało , enzym i substrat , receptor i ligand lub białka i kwasy nukleinowe są często wykorzystywane do izolacji różnych biocząsteczek. Chromatografia powinowactwa jest przydatna ze względu na wysoką selektywność i rozdzielczość rozdziału w porównaniu z innymi metodami chromatograficznymi.

Zasada

Chromatografia powinowactwa wykorzystuje specyficzne oddziaływania wiązania między analitem będącym przedmiotem zainteresowania (normalnie rozpuszczonym w fazie ruchomej ) a partnerem wiązania lub ligandem (unieruchomionym na fazie stacjonarnej ). W typowym eksperymencie chromatografii powinowactwa, ligand jest przyłączony do stałej, nierozpuszczalnej matrycy - zwykle polimeru takiego jak agaroza lub poliakrylamid - modyfikowanego chemicznie w celu wprowadzenia reaktywnych grup funkcyjnych, z którymi ligand może reagować, tworząc trwałe wiązania kowalencyjne. Faza stacjonarna jest najpierw ładowana do kolumny, do której wprowadzana jest faza ruchoma. Cząsteczki, które wiążą się z ligandem, pozostaną związane z fazą stacjonarną. Następnie stosuje się bufor do płukania w celu usunięcia biocząsteczek innych niż docelowe poprzez zakłócenie ich słabszych interakcji z fazą stacjonarną, podczas gdy interesujące biocząsteczki pozostaną związane. Docelowe biocząsteczki można następnie usunąć przez zastosowanie tak zwanego buforu elucyjnego, który zakłóca interakcje między związanymi docelowymi biocząsteczkami a ligandem. W ten sposób cząsteczka docelowa jest odzyskiwana w roztworze eluującym.

Chromatografia powinowactwa nie wymaga znajomości masy cząsteczkowej, ładunku, hydrofobowości ani innych właściwości fizycznych analitu będącego przedmiotem zainteresowania, chociaż znajomość jego właściwości wiązania jest przydatna w projektowaniu protokołu rozdziału. Rodzaje oddziaływań wiążących powszechnie wykorzystywane w procedurach chromatografii powinowactwa podsumowano w poniższej tabeli.

Typowe interakcje biologiczne stosowane w chromatografii powinowactwa
s. nie Rodzaje ligandów Cząsteczka docelowa
1 Analog podłoża Enzymy
2 Przeciwciało Antygen
3 lektyna Polisacharyd
4 Kwasu nukleinowego Komplementarna sekwencja zasad
5 Hormon Chwytnik
6 Avidin Cząsteczka sprzężona z biotyną/biotyną
7 Kalmodulina Partner wiążący kalmodulinę
8 Glutation Białko fuzyjne GST
9 Białka A i G Immunoglobuliny
10 Jony metali Białko fuzyjne polihistydyny

Konfiguracja wsadowa i kolumnowa

Chromatografia kolumnowa
Chromatografia wsadowa

Wiązanie z fazą stałą można osiągnąć za pomocą chromatografii kolumnowej, w której podłoże stałe jest pakowane na kolumnę, początkowa mieszanina przepuszczana jest przez kolumnę, aby umożliwić osadzenie, bufor do płukania przepuszczany jest przez kolumnę, a bufor do elucji jest następnie nakładany na kolumnę i zbierany . Te etapy są zwykle wykonywane przy ciśnieniu otoczenia. Alternatywnie, wiązanie można osiągnąć stosując obróbkę okresową, na przykład przez dodanie początkowej mieszaniny do fazy stałej w naczyniu, mieszanie, oddzielanie fazy stałej, usuwanie fazy ciekłej, przemycie, ponowne odwirowanie, dodanie buforu do elucji, ponowne wirowanie i usuwanie eluatu.

Czasami stosuje się metodę hybrydową, tak że wiązanie odbywa się metodą okresową, ale faza stała ze związaną cząsteczką docelową jest pakowana na kolumnę, a płukanie i elucja odbywa się na kolumnie.

Ligandy stosowane w chromatografii powinowactwa są otrzymywane zarówno ze źródeł organicznych, jak i nieorganicznych. Przykładami źródeł biologicznych są białka surowicy, lektyny i przeciwciała. Źródła nieorganiczne, takie jak działanie kretynowe, chelaty metali i barwniki triazynowe.

Opracowano również trzecią metodę, absorpcję w złożu ekspandowanym, która łączy zalety dwóch wymienionych powyżej metod. Cząstki fazy stałej są umieszczane w kolumnie, do której faza ciekła jest pompowana od dołu i wypływa górą. Grawitacja cząstek zapewnia, że ​​faza stała nie opuści kolumny z fazą ciekłą.

Kolumny powinowactwa można eluować przez zmianę stężenia soli, pH, pI, ładunku i siły jonowej bezpośrednio lub poprzez gradient, aby rozdzielić cząstki będące przedmiotem zainteresowania.

Niedawno opracowano konfiguracje wykorzystujące więcej niż jedną kolumnę szeregowo. Zaletą w porównaniu z konfiguracjami z jedną kolumną jest to, że materiał żywiczny może być w pełni załadowany, ponieważ niewiążący produkt jest bezpośrednio przekazywany do kolejnej kolumny ze świeżym materiałem kolumny. Te procesy chromatograficzne są znane jako okresowa chromatografia przeciwprądowa (PCC). W ten sposób można drastycznie zmniejszyć koszty żywicy na ilość wytworzonego produktu. Ponieważ jedna kolumna może być zawsze eluowana i regenerowana, podczas gdy druga kolumna jest obciążona, już dwie kolumny wystarczą, aby w pełni wykorzystać zalety. Dodatkowe kolumny mogą zapewnić dodatkową elastyczność czasu elucji i regeneracji kosztem dodatkowego sprzętu i kosztów żywicy.

Specyficzne zastosowania

Chromatografia powinowactwa może być wykorzystywana w wielu zastosowaniach, w tym w oczyszczaniu kwasów nukleinowych, oczyszczaniu białek z ekstraktów bezkomórkowych i oczyszczaniu z krwi.

Stosując chromatografię powinowactwa, można oddzielić białka wiążące się z określonym fragmentem od białek, które nie wiążą tego konkretnego fragmentu. Ponieważ ta technika oczyszczania opiera się na właściwościach biologicznych potrzebnego białka, jest to przydatna technika, a białka można oczyszczać wielokrotnie w jednym etapie.

Różne media powinowactwa

Istnieje wiele różnych mediów powinowactwa do różnych możliwych zastosowań. Pokrótce, są one (uogólnione) aktywowane/funkcjonalizowane, które działają jako funkcjonalny przerywnik, macierz podtrzymująca i eliminują operowanie toksycznymi odczynnikami.

Podłoża aminokwasowe są używane z różnymi białkami, białkami, peptydami i enzymami surowicy, a także rRNA i dsDNA. Podłoża awidyno-biotynowe wykorzystywane są w procesie oczyszczania biotyny/awidyny i ich pochodnych.

Wiązanie węglowodanowe jest najczęściej stosowane z glikoproteinami lub jakąkolwiek inną substancją zawierającą węglowodany; Węglowodan stosuje się z lektynami, glikoproteinami lub jakimkolwiek innym węglowodanowym metabolitem białka. Pożywka z ligandem barwnika jest niespecyficzna, ale naśladuje biologiczne substraty i białka. Glutation jest przydatny do oddzielania rekombinowanych białek znakowanych GST. Heparyna jest uogólnionym ligandem powinowactwa i jest najbardziej przydatna do oddzielania białek krzepnięcia osocza wraz z enzymami kwasu nukleinowego i lipazami

Media do oddziaływań hydrofobowych są najczęściej stosowane do celowania w wolne grupy karboksylowe i białka.

Podłoże do powinowactwa immunologicznego (opisane poniżej) wykorzystuje wysoką specyficzność antygenów i przeciwciał do rozdzielenia; Chromatografia powinowactwa do unieruchomionych metali jest szczegółowo opisana poniżej i wykorzystuje interakcje między jonami metali i białkami (zwykle specjalnie znakowane) do rozdzielenia; nukleotyd/koenzym, który działa w celu oddzielenia dehydrogenaz, kinaz i transaminaz.

Kwasy nukleinowe działają w celu wychwytywania mRNA, DNA, rRNA i innych kwasów nukleinowych/oligonukleotydów. Do oczyszczania immunoglobulin stosuje się metodę Protein A/G.

Podłoża specjalne są zaprojektowane dla określonej klasy lub typu białka/koenzymu; ten rodzaj mediów będzie działał tylko w celu oddzielenia określonego białka lub koenzymu.

Powinowactwo immunologiczne

Innym zastosowaniem zabiegu jest oczyszczanie powinowactwa przeciwciał z surowicy krwi. Jeśli wiadomo, że surowica zawiera przeciwciała przeciwko określonemu antygenowi (na przykład, jeśli surowica pochodzi z organizmu immunizowanego przeciwko danemu antygenowi), można ją stosować do oczyszczania tego antygenu metodą powinowactwa. Jest to również znane jako chromatografia immunopowinowactwa. Na przykład, jeśli organizm jest immunizowany przeciwko białku fuzyjnemu GST, będzie wytwarzał przeciwciała przeciwko białku fuzyjnemu i prawdopodobnie również przeciwciała przeciwko znacznikowi GST. Białko można następnie kowalencyjnie sprzęgać ze stałym podłożem, takim jak agaroza i stosować jako ligand powinowactwa w oczyszczaniu przeciwciała z surowicy odpornościowej.

Dla dokładności, białko GST i białko fuzyjne GST można sprzęgać oddzielnie. Surowica początkowo może związać się z macierzą powinowactwa GST. Spowoduje to usunięcie przeciwciał przeciwko części GST białka fuzyjnego. Surowica jest następnie oddzielana od stałego nośnika i pozwalana na związanie się z macierzą białka fuzyjnego GST. Pozwala to na wychwytywanie dowolnych przeciwciał, które rozpoznają antygen, na podłożu stałym. Elucję przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania najczęściej osiąga się stosując bufor o niskim pH, taki jak glicyna o pH 2,8. Eluat zbiera się do obojętnego buforu tris lub fosforanowego, aby zneutralizować bufor elucyjny o niskim pH i zatrzymać jakąkolwiek degradację aktywności przeciwciała. Jest to dobry przykład, ponieważ oczyszczanie metodą powinowactwa stosuje się do oczyszczenia początkowego białka fuzyjnego GST, usunięcia niepożądanych przeciwciał anty-GST z surowicy i oczyszczenia przeciwciała docelowego.

Przeciwciała monoklonalne można również wybrać tak, aby wiązały białka z dużą swoistością, gdzie białko jest uwalniane w dość łagodnych warunkach. Może się to przydać do dalszych badań w przyszłości.

Do oczyszczania przeciwciał wytworzonych przeciwko antygenom peptydowym często stosuje się uproszczoną strategię . Gdy antygeny peptydowe są wytwarzane syntetycznie, na końcu N lub C peptydu dodaje się końcową resztę cysteiny . Ta reszta cysteinowa zawiera sulfhydrylową grupę funkcyjną, która umożliwia łatwe sprzęganie peptydu z białkiem nośnikowym (np. hemocyjanina skałoczepa (KLH)). Ten sam peptyd zawierający cysteinę jest również unieruchamiany na żywicy agarozowej przez resztę cysteiny, a następnie stosowany do oczyszczania przeciwciała.

Większość przeciwciał monoklonalnych została oczyszczona za pomocą chromatografii powinowactwa opartej na specyficznym dla immunoglobuliny białku A lub białku G , pochodzącym z bakterii.

Chromatografia immunopowinowactwa z przeciwciałami monoklonalnymi unieruchomionymi na monolitycznej kolumnie została z powodzeniem zastosowana do wychwytywania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (np. egzosomów i egzomerów) z ludzkiego osocza krwi poprzez celowanie w tetraspaniny i integryny znajdujące się na powierzchni EV.

Chromatografia immunopowinowactwa jest również podstawą testów immunochromatograficznych (ICT), które zapewniają szybką diagnostykę w opiece nad pacjentem. Korzystając z technologii ICT, technik może dokonać ustalenia przy łóżku pacjenta, bez konieczności korzystania z laboratorium. Wykrywanie ICT jest wysoce specyficzne dla drobnoustroju powodującego infekcję.

Chromatografia powinowactwa do immobilizowanych jonów metali

Chromatografia powinowactwa do immobilizowanych jonów metali (IMAC) opiera się na specyficznym koordynacyjnym wiązaniu kowalencyjnym aminokwasów, zwłaszcza histydyny, z metalami. Ta technika działa poprzez umożliwienie zatrzymywania białek z powinowactwem do jonów metali w kolumnie zawierającej unieruchomione jony metali, takich jak kobalt, nikiel lub miedź w celu oczyszczenia białek lub peptydów zawierających histydynę, żelazo, cynk lub gal w celu oczyszczenia fosforylowanych białek lub peptydów. Wiele naturalnie występujących białek nie ma powinowactwa do jonów metali, dlatego do wprowadzenia takiego znacznika białkowego do odpowiedniego genu można zastosować technologię rekombinacji DNA . Metody stosowane do elucji białka będącego przedmiotem zainteresowania obejmują zmianę pH lub dodanie konkurencyjnej cząsteczki, takiej jak imidazol .

Kolumna chromatograficzna zawierająca kulki niklowo-agarozowe do oczyszczania białek z tagami histydynowymi

Białka rekombinowane

Prawdopodobnie najczęstszym zastosowaniem chromatografii powinowactwa jest oczyszczanie białek rekombinowanych. Białka o znanym powinowactwie są znakowane w celu ułatwienia ich oczyszczania. Białko mogło być genetycznie zmodyfikowane tak, aby umożliwić jego selekcję pod kątem wiązania powinowactwa; jest to znane jako białko fuzyjne. Znaczniki obejmują heksahistydynę ( His ), S-transferazę glutationową (GST) i białko wiążące maltozę (MBP). Znaczniki histydynowe wykazują powinowactwo do jonów niklu , kobaltu , cynku , miedzi i żelaza , które zostały unieruchomione przez utworzenie koordynacyjnych wiązań kowalencyjnych z chelatorem wprowadzonym do fazy stacjonarnej. Do elucji stosuje się nadmiarową ilość związku zdolnego do działania jako ligand jonu metalu, takiego jak imidazol . GST wykazuje powinowactwo do glutationu, który jest dostępny w handlu unieruchomiony jako agaroza glutationowa. Podczas elucji nadmiar glutationu jest używany do wyparcia znakowanego białka.

Lektyny

Lektyny chromatografii powinowactwa jest postać chromatografii powinowactwa, gdzie lektyny są stosowane do oddzielania składników w próbce. Lektyny, takie jak konkanawalina A, są białkami, które mogą wiązać specyficzne cząsteczki węglowodanów alfa-D-mannozy i alfa-D-glukozy. Niektóre typowe cząsteczki węglowodanów stosowane w chromatografii powinowactwa do lektyn to Con A-Sepharose i WGA-agaroza. Innym przykładem lektyny jest aglutynina z kiełków pszenicy, która wiąże DN-acetylo-glukozaminę. Najczęstszym zastosowaniem jest oddzielenie glikoprotein od białek nieglikozylowanych lub jednej glikoformy od innej glikoformy. Chociaż istnieją różne sposoby przeprowadzenia chromatografii powinowactwa do lektyn, celem jest wyekstrahowanie liganda cukrowego pożądanego białka.

Specjalność

Innym zastosowaniem chromatografii powinowactwa jest oczyszczanie określonych białek przy użyciu macierzy żelowej, która jest unikalna dla określonego białka. Na przykład, oczyszczanie β-galaktozydazy E. coli przeprowadza się przez chromatografię powinowactwa z użyciem p-aminobenylo-1-tio-β-D-galaktopiranozyloagarozy jako matrycy powinowactwa. Jako matrycę powinowactwa stosuje się p-aminobenylo-1-tio-β-D-galaktopiranozyloagaroza, ponieważ zawiera ona grupę galaktopiranozylową, która służy jako dobry analog substratu dla E. coli-B-galaktozydazy. Ta właściwość umożliwia wiązanie się enzymu z fazą stacjonarną matrycy powinowactwa i jest eluowana przez dodawanie do kolumny rosnących stężeń soli.

Fosfatazy alkalicznej

Fosfataza alkaliczna z E. coli może być oczyszczona przy użyciu matrycy DEAE-celuloza. A. fosfataza ma niewielki ładunek ujemny, dzięki czemu słabo wiąże się z dodatnio naładowanymi grupami aminowymi w matrycy. Enzym można następnie wymyć przez dodanie buforu o wyższym stężeniu soli.

Chromatografia powinowactwa boronianowego

Chromatografia powinowactwa boronianowego polega na zastosowaniu kwasu boronowego lub boronianów do elucji i ilościowego oznaczenia ilości glikoprotein . Adaptacje kliniczne zastosowały ten typ chromatografii do stosowania w określaniu długoterminowej oceny pacjentów z cukrzycą poprzez analizę ich hemoglobiny glikowanej .

Oczyszczanie albuminy w surowicy

Spośród wielu zastosowań chromatografii powinowactwa jedno z nich jest widoczne w oczyszczaniu metodą powinowactwa zanieczyszczenia albuminą i makroglobuliną. Ten rodzaj oczyszczania jest pomocny w usuwaniu nadmiaru zanieczyszczeń albuminami i α 2 -makroglobuliną podczas wykonywania spektrometrii mas. W oczyszczaniu przez powinowactwo albuminy surowicy, urządzeniem stacjonarnym używanym do zbierania lub przyciągania białek surowicy może być Cibacron Blue-Sepharose. Następnie białka surowicy można wymyć z adsorbentu buforem zawierającym tiocyjanian (SCN ).

Słaba chromatografia powinowactwa

Chromatografia słabego powinowactwa (WAC) to technika chromatografii powinowactwa do badań przesiewowych powinowactwa w opracowywaniu leków. WAC jest techniką chromatografii cieczowej opartą na powinowactwie , która oddziela związki chemiczne w oparciu o ich różne słabe powinowactwo do unieruchomionego celu. Im wyższe powinowactwo związku do celu, tym dłużej pozostaje w jednostce rozdzielającej, co zostanie wyrażone jako dłuższy czas retencji. Miarę powinowactwa i ranking powinowactwa można uzyskać, przetwarzając otrzymane czasy retencji analizowanych związków.

Technologia WAC została zademonstrowana przeciwko wielu różnym celom białkowymproteazom , kinazom , chaperonom i celom interakcji białko-białko (PPI). Wykazano, że metoda WAC jest bardziej skuteczna niż ustalone metody badań przesiewowych opartych na fragmentach.

Historia

Chromatografia powinowactwa została wymyślona i po raz pierwszy opracowana przez Pedro Cuatrecasas i Meir Wilchek .

Bibliografia

Linki zewnętrzne

„Zasada chromatografii powinowactwa, procedura i szczegółowa uwaga – 2020”.