Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ -Fluorescence in situ hybridization

Wizualizacja multipleksowego RNA w komórkach przy użyciu testów ViewRNA FISH
Komórka metafazowa pozytywna dla rearanżacji bcr/abl (związanej z przewlekłą białaczką szpikową ) przy użyciu FISH. Chromosomy są widoczne na niebiesko. Chromosom oznaczony zielonymi i czerwonymi plamkami (u góry po lewej) to ten, w którym występuje przegrupowanie.

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ ( FISH ) to molekularna technika cytogenetyczna wykorzystująca sondy fluorescencyjne, które wiążą się tylko z określonymi częściami sekwencji kwasu nukleinowego z wysokim stopniem komplementarności sekwencji . Został opracowany przez badaczy biomedycznych we wczesnych latach 80-tych w celu wykrywania i lokalizowania obecności lub nieobecności określonych sekwencji DNA na chromosomach . Mikroskopia fluorescencyjna może być wykorzystana do ustalenia, gdzie sonda fluorescencyjna jest związana z chromosomami. FISH jest często używany do wyszukiwania specyficznych cech DNA do wykorzystania w poradnictwie genetycznym , medycynie i identyfikacji gatunku. FISH może być również stosowany do wykrywania i lokalizacji określonych celów RNA ( mRNA , lncRNA i miRNA ) w komórkach, krążących komórkach nowotworowych i próbkach tkanek. W tym kontekście może pomóc w określeniu przestrzenno-czasowych wzorców ekspresji genów w komórkach i tkankach.

Sondy – RNA i DNA

Wykrywanie ViewRNA miR-133 (zielony) i mRNA miogeniny (czerwony) w komórkach różnicujących się C2C12

W biologii sonda to pojedyncza nić DNA lub RNA, która jest komplementarna do interesującej sekwencji nukleotydowej.

Sondy RNA można zaprojektować dla dowolnego genu lub dowolnej sekwencji w genie do wizualizacji mRNA , lncRNA i miRNA w tkankach i komórkach. FISH wykorzystuje się do badania cyklu rozmnażania komórkowego, w szczególności interfazy jąder pod kątem wszelkich nieprawidłowości chromosomalnych. FISH pozwala na znacznie łatwiejszą analizę dużej serii archiwalnych przypadków zidentyfikowania wskazanego chromosomu poprzez stworzenie sondy ze sztuczną podstawą chromosomową, która będzie przyciągać podobne chromosomy. Sygnały hybrydyzacji dla każdej sondy po wykryciu nieprawidłowości jądra. Każda sonda do wykrywania mRNA i lncRNA składa się z około 20-50 par oligonukleotydów, każda para zajmuje przestrzeń 40-50 pz. Specyfika zależy od konkretnej zastosowanej techniki FISH. Do wykrywania miRNA sondy wykorzystują zastrzeżoną chemię do specyficznego wykrywania miRNA i pokrywają całą sekwencję miRNA.

Komórki urotelialne oznaczone czterema różnymi sondami

Sondy często pochodzą z fragmentów DNA, które zostały wyizolowane, oczyszczone i zamplifikowane do wykorzystania w Projekcie Genomu Ludzkiego . Wielkość ludzkiego genomu jest tak duża w porównaniu z długością, którą można by zsekwencjonować bezpośrednio, że konieczne było podzielenie genomu na fragmenty. (W ostatecznej analizie fragmenty te zostały uporządkowane poprzez trawienie kopii każdego fragmentu na jeszcze mniejsze fragmenty przy użyciu endonukleaz specyficznych dla sekwencji, pomiar wielkości każdego małego fragmentu przy użyciu chromatografii wykluczania i wykorzystanie tych informacji do określenia, gdzie duże fragmenty nakładały się na siebie.) Aby zachować fragmenty z ich indywidualnymi sekwencjami DNA, fragmenty dodano do systemu stale replikujących się populacji bakterii. Populacje klonalne bakterii, z których każda utrzymuje jeden sztuczny chromosom, są przechowywane w różnych laboratoriach na całym świecie. Sztuczne chromosomy ( BAC ) można hodować, ekstrahować i znakować w dowolnym laboratorium zawierającym bibliotekę. Biblioteki genomowe są często nazywane po instytucji, w której zostały opracowane. Przykładem jest biblioteka RPCI-11, której nazwa pochodzi od Roswell Park Comprehensive Cancer Center (wcześniej znanego jako Roswell Park Cancer Institute) w Buffalo w stanie Nowy Jork . Fragmenty te są rzędu 100 tysięcy par zasad i stanowią podstawę większości sond FISH.

Proces przygotowania i hybrydyzacji – RNA

Komórki, krążące komórki nowotworowe (CTC) lub utrwalone w formalinie zatopione w parafinie (FFPE) lub zamrożone skrawki tkanek są utrwalane, a następnie permeabilizowane, aby umożliwić dostęp do celu. FISH został również z powodzeniem wykonany na nieutrwalonych komórkach. Sonda specyficzna dla celu, składająca się z 20 par oligonukleotydów, hybrydyzuje z docelowym(-i) RNA(-ami). Oddzielne, ale kompatybilne systemy wzmacniania sygnału umożliwiają test multipleksowy (do dwóch celów na test). Wzmocnienie sygnału uzyskuje się poprzez szereg kolejnych etapów hybrydyzacji. Pod koniec testu próbki tkanek są wizualizowane pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Proces przygotowania i hybrydyzacji – DNA

Schemat zasady Eksperymentu FISH do lokalizacji genu w jądrze.

Najpierw konstruowana jest sonda. Sonda musi być wystarczająco duża, aby hybrydyzować specyficznie ze swoim celem, ale nie tak duża, aby utrudniać proces hybrydyzacji. Sonda jest bezpośrednio znakowana fluoroforami , celami dla przeciwciał lub biotyną . Znakowanie można wykonać na różne sposoby, takie jak nick translation lub reakcja łańcuchowa polimerazy przy użyciu znakowanych nukleotydów .

Następnie wytwarzany jest preparat chromosomu międzyfazowego lub metafazowego . Chromosomy są mocno przytwierdzone do podłoża , zwykle szkła. Powtarzające się sekwencje DNA należy zablokować poprzez dodanie do próbki krótkich fragmentów DNA. Sonda jest następnie nakładana na chromosomowy DNA i inkubowana przez około 12 godzin podczas hybrydyzacji. Kilka etapów płukania usuwa wszystkie niezhybrydyzowane lub częściowo zhybrydyzowane sondy. Wyniki są następnie wizualizowane i określane ilościowo za pomocą mikroskopu zdolnego do wzbudzania barwnika i rejestrowania obrazów.

Jeżeli sygnał fluorescencyjny jest słaby, może być konieczne wzmocnienie sygnału w celu przekroczenia progu detekcji mikroskopu . Siła sygnału fluorescencyjnego zależy od wielu czynników, takich jak wydajność znakowania sondy, typ sondy i rodzaj barwnika. Z cząsteczką barwnika wiążą się przeciwciała znakowane fluorescencyjnie lub streptawidyna . Te drugorzędne komponenty są tak dobrane, aby miały silny sygnał.

Wariacje dotyczące sond i analizy

FISH to bardzo ogólna technika. Różnice między różnymi technikami FISH wynikają zwykle z różnic w sekwencji i znakowaniu sond; i jak są używane w połączeniu. Sondy dzielą się na dwie ogólne kategorie: komórkowe i bezkomórkowe. W fluorescencyjnej hybrydyzacji „in situ” oznacza umieszczenie sondy w komórce

Rozmiar sondy jest ważny, ponieważ dłuższe sondy hybrydyzują mniej specyficznie niż sondy krótsze, tak więc do zlokalizowania celu często używa się krótkich nici DNA lub RNA (często 10–25 nukleotydów), które są komplementarne do danej sekwencji docelowej. Nakładanie określa rozdzielczość wykrywalnych cech. Na przykład, jeśli celem eksperymentu jest wykrycie punktu przerwania translokacji , wówczas nakładanie się sond — stopień, w jakim jedna sekwencja DNA jest zawarta w sąsiednich sondach — określa minimalne okno, w którym punkt przerwania może zostać wykryty .

Mieszanina sekwencji sondy określa typ cechy, którą sonda może wykryć. Sondy, które hybrydyzują wzdłuż całego chromosomu, są używane do zliczania liczby określonego chromosomu, wykazywania translokacji lub identyfikacji pozachromosomalnych fragmentów chromatyny . Nazywa się to często „malowaniem całego chromosomu”. Gdyby zastosować każdą możliwą sondę, każdy chromosom (cały genom) byłby oznaczony fluorescencyjnie, co nie byłoby szczególnie przydatne do określania cech poszczególnych sekwencji. Jednak możliwe jest stworzenie mieszaniny mniejszych sond, które są specyficzne dla określonego regionu (locus) DNA; mieszaniny te są wykorzystywane do wykrywania mutacji delecyjnych . W połączeniu z określonym kolorem, do wykrywania bardzo specyficznych translokacji stosuje się mieszaninę sond specyficzną dla miejsca. Specjalne mieszaniny sond specyficznych dla locus są często używane do zliczania chromosomów, poprzez wiązanie się z centromerowymi regionami chromosomów, które są wystarczająco charakterystyczne, aby zidentyfikować każdy chromosom (z wyjątkiem Chromosomu 13 , 14 , 21 , 22 ).

Wiele innych technik wykorzystuje mieszaniny różnokolorowych sond. W mieszaninach barwników fluorescencyjnych można wykryć szereg kolorów, dzięki czemu każdy ludzki chromosom można zidentyfikować za pomocą charakterystycznego koloru przy użyciu mieszanin sond całego chromosomu i różnych proporcji kolorów. Chociaż istnieje więcej chromosomów niż łatwo rozróżnialnych kolorów barwników fluorescencyjnych, proporcje mieszanin sond można wykorzystać do stworzenia kolorów drugorzędowych . Podobnie do porównawczej hybrydyzacji genomowej , mieszanina sond dla kolorów drugorzędowych jest tworzona przez zmieszanie właściwych proporcji dwóch zestawów różnie zabarwionych sond dla tego samego chromosomu. Ta technika jest czasami nazywana M-FISH.

Ta sama fizyka, która umożliwia stosowanie różnych kolorów w M-FISH, może zostać wykorzystana do wykrywania translokacji. Oznacza to, że kolory sąsiadujące wydają się nakładać na siebie; obserwuje się kolor wtórny. Niektóre testy zaprojektowano tak, aby w przypadkach zainteresowania występował lub nie występował kolor drugorzędowy. Przykładem jest wykrywanie translokacji BCR/ABL , gdzie kolor wtórny wskazuje na chorobę. Ta odmiana jest często nazywana podwójną fuzją FISH lub D-FISH. W odwrotnej sytuacji — gdy brak koloru drugorzędowego jest patologiczny — ilustruje test stosowany do badania translokacji, w którym tylko jeden z punktów przerwania jest znany lub stały. Sondy specyficzne dla locus są wykonane dla jednej strony punktu przerwania, a drugiej nienaruszonego chromosomu. W normalnych komórkach obserwuje się kolor wtórny, ale w przypadku translokacji obserwuje się tylko kolory podstawowe. Ta technika jest czasami nazywana "odłamywaniem RYBY".

Jednocząsteczkowe RYBY RNA

Jednocząsteczkowa FISH RNA, znana również jako Stellaris® RNA FISH, to metoda wykrywania i oznaczania ilościowego mRNA i innych długich cząsteczek RNA w cienkiej warstwie próbki tkanki. Cele można wiarygodnie obrazować poprzez zastosowanie wielu krótkich, pojedynczo znakowanych sond oligonukleotydowych . Wiązanie do 48 znakowanych fluorescencyjnie oligonukleotydów z pojedynczą cząsteczką mRNA zapewnia wystarczającą fluorescencję, aby dokładnie wykryć i zlokalizować każdy docelowy mRNA na obrazie mikroskopii fluorescencyjnej o szerokim polu . Sondy niewiążące się z zamierzoną sekwencją nie osiągają wystarczającej zlokalizowanej fluorescencji, aby odróżnić ją od tła .

Testy FISH dla pojedynczych cząsteczek RNA mogą być przeprowadzane w trybie simplex lub multiplex i mogą być stosowane jako eksperyment uzupełniający po ilościowej reakcji PCR lub obrazowane jednocześnie z testem przeciwciał fluorescencyjnych . Technologia ma potencjalne zastosowania w diagnostyce raka , neuronauce , analizie ekspresji genów i diagnostyce towarzyszącej .

Włókno RYBA

W technice alternatywnej do preparatów interfazowych lub metafazowych, błonnik FISH, chromosomy interfazowe są przymocowane do szkiełka w taki sposób, że są rozciągnięte w linii prostej, a nie ciasno zwinięte, jak w konwencjonalnym FISH, lub adoptujące terytorium chromosomów konformacja, jak w interfazie FISH. Osiąga się to poprzez zastosowanie mechanicznego ścinania wzdłuż szkiełka, albo do komórek, które zostały przymocowane do szkiełka, a następnie poddane lizie , albo do roztworu oczyszczonego DNA. W tym celu coraz częściej stosuje się technikę znaną jako czesanie chromosomów . Rozszerzona konformacja chromosomów pozwala na znacznie wyższą rozdzielczość – nawet do kilku kilozasad . Przygotowanie próbek błonnika FISH, chociaż koncepcyjnie proste, jest dość wykwalifikowaną sztuką i tylko wyspecjalizowane laboratoria rutynowo stosują tę technikę.

Q-RYBY

Główny artykuł: Q-FISH

Q-FISH łączy FISH z PNA i oprogramowaniem komputerowym do ilościowej oceny intensywności fluorescencji. Technika ta jest rutynowo stosowana w badaniach długości telomerów .

Flow-FISH

Główny artykuł: Flow-FISH

Flow-FISH wykorzystuje cytometrię przepływową do automatycznego wykonywania FISH przy użyciu pomiarów fluorescencji na komórkę.

MA-RYBY

Technologia FISH wspomagana mikroprzepływami ( MA-FISH ) wykorzystuje przepływ mikroprzepływowy w celu zwiększenia wydajności hybrydyzacji DNA, zmniejszenia zużycia drogiej sondy FISH i skrócenia czasu hybrydyzacji. MA-FISH służy do wykrywania genu HER2 w tkankach raka piersi.

MAR-RYBY

Mikroautoradiografia FISH to technika łączenia znakowanych radioaktywnie substratów z konwencjonalnym FISH w celu jednoczesnego wykrywania grup filogenetycznych i aktywności metabolicznej.

Hybrydowa Fuzja-RYBY

Hybrid Fusion FISH ( HF-FISH ) wykorzystuje pierwotne addytywne połączenie wzbudzenia/emisji fluoroforów w celu wygenerowania dodatkowych widm w procesie znakowania znanym jako dynamiczna transmisja optyczna (DOT). Trzy pierwotne fluorofory są w stanie wygenerować łącznie 7 łatwo wykrywalnych widm emisyjnych w wyniku kombinatorycznego znakowania przy użyciu DOT. Hybrid Fusion FISH umożliwia wysoce zmultipleksowane aplikacje FISH, które są ukierunkowane na panele onkologii klinicznej. Technologia ta zapewnia szybszą ocenę dzięki wydajnym zestawom sond, które można łatwo wykryć za pomocą tradycyjnych mikroskopów fluorescencyjnych.

Zastosowania medyczne

Często rodzice dzieci z niepełnosprawnością rozwojową chcą wiedzieć więcej o stanie swojego dziecka, zanim zdecydują się na kolejne dziecko. Problemy te można rozwiązać poprzez analizę DNA rodziców i dziecka. W przypadkach, gdy niepełnosprawność rozwojowa dziecka nie jest zrozumiała, jej przyczynę można potencjalnie ustalić za pomocą FISH i technik cytogenetycznych . Przykłady chorób, które rozpoznaje się przy użyciu FISH obejmują zespół Pradera-Williego , zespół Angelmana , 22q13 usunięcia zespołu , przewlekłą białaczkę szpikową , ostrą białaczkę szpikową , Cri du chat , zespół Velocardiofacial i zespół Downa . FISH na plemnikach jest wskazane dla mężczyzn z nieprawidłowym kariotypem somatycznym lub mejotycznym, a także z oligozoospermią , ponieważ około 50% mężczyzn z oligozoospermią ma podwyższony odsetek nieprawidłowości chromosomalnych plemników. Analiza chromosomów 21, X i Y wystarcza do identyfikacji zagrożonych osobników oligozoospermicznych.

W medycynie FISH może być wykorzystywane do postawienia diagnozy , oceny rokowania lub oceny remisji choroby, takiej jak rak . Leczenie może być wtedy specjalnie dostosowane. Tradycyjne badanie obejmujące metafazową analizę chromosomów często nie jest w stanie zidentyfikować cech, które odróżniają jedną chorobę od drugiej, ze względu na subtelne cechy chromosomalne; FISH może wyjaśnić te różnice. FISH może być również stosowany do wykrywania chorych komórek łatwiej niż standardowe metody cytogenetyczne , które wymagają podziału komórek i wymagają pracochłonnego i czasochłonnego ręcznego przygotowania i analizy preparatów przez technologa. Z drugiej strony FISH nie wymaga żywych komórek i może być określana ilościowo automatycznie, komputer zlicza obecne kropki fluorescencyjne. Jednak do rozróżnienia subtelnych różnic we wzorach prążków na zgiętych i skręconych chromosomach metafazowych potrzebny jest przeszkolony technolog. FISH można włączyć do mikroprzepływowego urządzenia Lab-on-a-chip . Ta technologia jest wciąż w fazie rozwoju, ale podobnie jak inne metody laboratoryjne na chipie, może prowadzić do bardziej przenośnych technik diagnostycznych.

Ta rycina przedstawia proces fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) stosowanej do identyfikacji patogenów. Najpierw od pacjenta pobierana jest próbka zainfekowanej tkanki. Następnie syntetyzowany jest oligonukleotyd komplementarny do kodu genetycznego podejrzanego patogenu i znakowany chemicznie sondą fluorescencyjną. Pobraną próbkę tkanki należy następnie poddać obróbce chemicznej, aby błony komórkowe były przepuszczalne dla znakowanego fluorescencyjnie oligonukleotydu. Po potraktowaniu próbki tkanki dodaje się znakowany komplementarny oligonukleotyd. Znakowany fluorescencyjnie oligonukleotyd będzie wiązał się tylko z komplementarnym DNA podejrzanego patogenu. Jeśli patogen jest obecny w próbce tkanki, komórki patogenu będą świecić/fluorescencji po potraktowaniu znakowanym oligonukleotydem. Wszystkie inne komórki nie będą świecić po zabiegu.
Ogólny proces hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH) stosowany do identyfikacji patogenów bakteryjnych. Najpierw od pacjenta pobierana jest próbka zainfekowanej tkanki. Następnie syntetyzowany jest oligonukleotyd komplementarny do kodu genetycznego podejrzanego patogenu i znakowany chemicznie sondą fluorescencyjną. Próbka tkanki jest poddawana obróbce chemicznej w celu uzyskania przepuszczalności błon komórkowych dla znakowanego fluorescencyjnie oligonukleotydu. Następnie dodawany jest znacznik fluorescencyjny, który wiąże się tylko z komplementarnym DNA podejrzanego patogenu. Jeśli patogen jest obecny w próbce tkanki, komórki patogenu będą fluoryzować po potraktowaniu znakowanym oligonukleotydem. Żadne inne komórki nie będą się świecić.

Identyfikacja gatunku

FISH był szeroko badany jako technika diagnostyczna do identyfikacji patogenów w dziedzinie mikrobiologii medycznej. Chociaż udowodniono, że jest to technika użyteczna i stosowana, nadal nie jest powszechnie stosowana w laboratoriach diagnostycznych. Krótki czas do diagnozy (mniej niż 2 godziny) był główną zaletą w porównaniu z różnicowaniem biochemicznym, ale ta zaleta jest kwestionowana przez MALDI-TOF-MS, który pozwala na identyfikację szerszego zakresu patogenów w porównaniu z technikami różnicowania biochemicznego. Wykorzystanie FISH do celów diagnostycznych znalazło swój cel, gdy potrzebna jest natychmiastowa identyfikacja gatunku, szczególnie do badania posiewów krwi, dla których FISH jest tanią i łatwą techniką wstępnej szybkiej diagnozy.

FISH można również wykorzystać do porównania genomów dwóch gatunków biologicznych , aby wywnioskować powiązania ewolucyjne . Podobna technika hybrydyzacji nazywana jest zoo blot . Bakteryjne sondy FISH są często starterami dla regionu 16s rRNA .

FISH jest szeroko stosowana w dziedzinie ekologii drobnoustrojów do identyfikacji mikroorganizmów . Na przykład biofilmy składają się ze złożonych (często) wielogatunkowych organizacji bakteryjnych. Przygotowanie sond DNA dla jednego gatunku i wykonanie FISH za pomocą tej sondy pozwala na wizualizację rozmieszczenia tego konkretnego gatunku w biofilmie. Przygotowanie sond (w dwóch różnych kolorach) dla dwóch gatunków pozwala naukowcom na wizualizację/badanie kolokalizacji tych dwóch gatunków w biofilmie i może być przydatne w określaniu drobnej architektury biofilmu.

Porównawcza hybrydyzacja genomowa

Porównawcza hybrydyzacja genomowa może być opisana jako metoda wykorzystująca FISH w sposób równoległy z porównaniem siły hybrydyzacji w celu przypomnienia wszelkich większych zakłóceń w procesie duplikacji sekwencji DNA w genomie jądra.

Wirtualny kariotyp

Wirtualne kariotypowanie to kolejna opłacalna, klinicznie dostępna alternatywa dla paneli FISH, wykorzystująca tysiące do milionów sond na jednej macierzy do wykrywania zmian liczby kopii w całym genomie, z niespotykaną dotąd rozdzielczością. Obecnie ten rodzaj analizy wykryje tylko zyski i straty materiału chromosomalnego i nie wykryje zrównoważonych rearanżacji, takich jak translokacje i inwersje, które są charakterystycznymi aberracjami obserwowanymi w wielu typach białaczki i chłoniaka.

Kariotyp spektralny

Kariotypowanie spektralne to obraz kolorowych chromosomów. Kariotypowanie spektralne obejmuje FISH przy użyciu wielu form wielu typów sond, w wyniku czego każdy chromosom jest znakowany na etapie metafazy. Ten rodzaj kariotypowania jest używany szczególnie podczas wyszukiwania układów chromosomowych.

Zobacz też

Galeria

  • Kolejny schemat procesu FISH.

  • Mikroprzepływowy układ scalony, który obniżył koszt testu FISH o 90%.

  • Obraz RYBY z podwójną etykietą; Bifidobakterie Cy3, Całkowita ilość bakterii FITC.

  • Paraspeckles wizualizowane za pomocą jednocząsteczkowej FISH przeciwko NEAT1 (Quasar 570) w komórkach U-2 OS (DAPI).

Bibliografia

Dalsza lektura

Zewnętrzne linki