Fiksacja (histologia) - Fixation (histology)
W dziedzinie histologii , patologii i biologii komórki , utrwalanie jest zachowanie tkanek biologicznych przed próchnicą powodu autolizy lub gnicia . Zatrzymuje wszelkie trwające reakcje biochemiczne, a także może zwiększać mechaniczną wytrzymałość lub stabilność leczonych tkanek. Utrwalanie tkanek jest krytycznym etapem w przygotowaniu skrawków histologicznych, a jego ogólnym celem jest zachowanie komórek i składników tkankowych w taki sposób, aby umożliwić przygotowanie cienkich, zabarwionych skrawków. Pozwala to na zbadanie struktury tkanek, która jest determinowana kształtem i wielkością takich makrocząsteczek (w komórkach i wokół komórek), jak białka i kwasy nukleinowe .
Cele
Pełniąc swoją ochronną rolę, utrwalacze denaturują białka przez koagulację, tworzenie związków addytywnych lub połączenie procesów koagulacji i addycji. Związek, który dodaje się chemicznie do makrocząsteczek najskuteczniej stabilizuje strukturę, jeśli jest w stanie połączyć się z częściami dwóch różnych makrocząsteczek, efekt znany jako sieciowanie. Utrwalanie tkanki odbywa się z kilku powodów. Jednym z powodów jest zabicie tkanki, aby zapobiec rozpadowi pośmiertnemu (autolizie i gniciu). Utrwalanie zachowuje materiał biologiczny ( tkankę lub komórki ) jak najbardziej zbliżony do stanu naturalnego w procesie przygotowania tkanki do badania. Aby to osiągnąć, zazwyczaj musi być spełnionych kilka warunków.
Po pierwsze, utrwalacz zwykle działa w celu dezaktywacji wewnętrznych biocząsteczek – zwłaszcza enzymów proteolitycznych – które w przeciwnym razie trawią lub uszkadzają próbkę.
Po drugie, utrwalacz zazwyczaj chroni próbkę przed zewnętrznym uszkodzeniem. Środki utrwalające są toksyczne dla większości powszechnych mikroorganizmów ( w szczególności bakterii ), które mogą występować w próbce tkanki lub w inny sposób kolonizować utrwaloną tkankę. Ponadto wiele utrwalaczy chemicznie zmienia utrwalony materiał, aby uczynić go mniej smakowitym (niestrawnym lub toksycznym) dla oportunistycznych mikroorganizmów.
Wreszcie, utrwalacze często zmieniają komórki lub tkanki na poziomie molekularnym, aby zwiększyć ich wytrzymałość mechaniczną lub stabilność. Ta zwiększona wytrzymałość i sztywność może pomóc w zachowaniu morfologii (kształtu i struktury) próbki podczas jej przetwarzania do dalszej analizy.
Nawet najbardziej ostrożne mocowanie zmienia próbkę i wprowadza artefakty, które mogą zakłócać interpretację ultrastruktury komórkowej. Znakomity przykład jest bakteryjny mezosom , który uważany za organelli w bakteriach Gram-dodatnich, w 1970 roku, a później wykazano nowych metod dla mikroskopii elektronowej się po prostu artefaktem mocowania chemicznej. Standaryzacja utrwalania i innych procedur przetwarzania tkanek uwzględnia to wprowadzenie artefaktów poprzez ustalenie, jakie procedury wprowadzają jakie rodzaje artefaktów. Naukowcy, którzy wiedzą, jakich typów artefaktów można się spodziewać w przypadku każdego typu tkanki i techniki przetwarzania, mogą dokładnie zinterpretować sekcje z artefaktami lub wybrać techniki, które minimalizują artefakty w obszarach zainteresowania.
Proces
Utrwalanie jest zwykle pierwszym etapem wieloetapowego procesu przygotowania próbki materiału biologicznego do mikroskopii lub innej analizy. Dlatego wybór utrwalacza i protokołu utrwalania może zależeć od zaplanowanych dodatkowych etapów przetwarzania i analiz końcowych. Na przykład immunohistochemia wykorzystuje przeciwciała, które wiążą się z określonym celem białkowym. Przedłużone utrwalanie może chemicznie maskować te cele i zapobiegać wiązaniu przeciwciał. W takich przypadkach zwykle stosuje się metodę „szybkiej naprawy” z użyciem zimnej formaliny przez około 24 godziny. Do szybkiego utrwalenia można również użyć metanolu (100%), a czas ten może się różnić w zależności od materiału biologicznego. Na przykład, komórki ludzkiego raka piersi MDA-MB 231 można utrwalić zimnym metanolem (-20°C) tylko przez 3 minuty. W przypadku badań lokalizacji enzymów, tkanki powinny być utrwalane wstępnie w niewielkim stopniu lub utrwalane później po utworzeniu produktu aktywności enzymatycznej.
Rodzaje
Ogólnie rzecz biorąc, istnieją trzy rodzaje procesów utrwalania w zależności od początkowej próbki:
Utrwalanie ciepłem: Po wyschnięciu rozmazu w temperaturze pokojowej szkiełko chwyta się szczypcami lub spinaczem do bielizny i kilkakrotnie przepuszcza przez płomień palnika Bunsena, aby zabić ciepło i przykleić organizm do szkiełka. Rutynowo stosowany z bakteriami i archeonami. Utrwalanie termiczne generalnie zachowuje ogólną morfologię, ale nie struktury wewnętrzne. Ciepło denaturuje enzym proteolityczny i zapobiega autolizie. Utrwalanie termiczne nie może być stosowane w metodzie barwienia torebki , ponieważ utrwalanie termiczne spowoduje zmniejszenie lub zniszczenie torebki ( glikokaliksu ) i nie będzie widoczne w plamach.
Zanurzenie: Próbkę tkanki zanurza się w roztworze utrwalającym o objętości co najmniej 20 razy większej niż objętość utrwalanej tkanki. Aby utrwalić środek utrwalający musi dyfundować przez tkankę, dlatego należy wziąć pod uwagę rozmiar i gęstość tkanki, a także rodzaj utrwalacza. Jest to powszechna technika w zastosowaniach komórkowych. Użycie większej próbki oznacza, że dotarcie utrwalacza do głębszych tkanek trwa dłużej.
Perfuzja: fiksacja poprzez przepływ krwi. Utrwalacz jest wstrzykiwany do serca w objętości odpowiadającej rzutowi serca. Utrwalacz rozprzestrzenia się po całym ciele, a tkanka nie obumiera, dopóki nie zostanie utrwalona. Ma to tę zaletę, że zachowuje doskonałą morfologię, ale wady polegają na tym, że osobnik umiera, a koszt ilości utrwalacza potrzebnego dla większych organizmów jest wysoki.
Utrwalanie chemiczne
Zarówno w procesie zanurzania, jak i perfuzji, utrwalacze chemiczne są stosowane w celu zachowania struktur w stanie (zarówno chemicznym, jak i strukturalnym) jak najbardziej zbliżonym do żywej tkanki. Wymaga to chemicznego utrwalacza.
Utrwalacze sieciujące – aldehydy
Utrwalacze sieciujące działają poprzez tworzenie kowalencyjnych wiązań chemicznych między białkami w tkance. To zakotwicza rozpuszczalne białka w cytoszkielecie i nadaje tkance dodatkową sztywność. Zachowanie przejściowej lub drobnej struktury cytoszkieletu, takiej jak skurcze podczas zarodkowych fal różnicowania, najlepiej osiągnąć przez wstępne traktowanie mikrofalami przed dodaniem utrwalacza sieciującego.
Najczęściej stosowanym środkiem utrwalającym w histologii jest formaldehyd . Zwykle stosuje się ją jako 10% obojętną buforowaną formalinę (NBF), czyli około. 3,7%–4,0% formaldehyd w buforze fosforanowym, pH 7. Ponieważ formaldehyd jest gazem w temperaturze pokojowej, do wytwarzania poprzedniego utrwalacza stosuje się formalinę – gazowy formaldehyd rozpuszczony w wodzie (~37% w/v). Formaldehyd utrwala tkankę poprzez sieciowanie białek, głównie reszt aminokwasu zasadowego lizyny . Jego działanie jest odwracalne dzięki nadmiarowi wody i unika pigmentacji formaliny. Paraformaldehyd jest również powszechnie stosowany i po podgrzaniu depolimeryzuje z powrotem do formaliny, co czyni go również skutecznym utrwalaczem. Inne zalety paraformaldehydu obejmują długotrwałe przechowywanie i dobrą penetrację tkanek. Jest szczególnie dobry w technikach immunohistochemicznych. Opary formaldehydu można również stosować jako utrwalacz do rozmazów komórkowych.
Innym popularnym aldehydem do utrwalania jest aldehyd glutarowy . Działa podobnie do formaldehydu, powodując deformację α-helis białek. Jednak aldehyd glutarowy jest większą cząsteczką niż formaldehyd i dlatego wolniej przenika przez błony. W konsekwencji utrwalanie aldehydem glutarowym na grubszych próbkach tkanek może być trudne; można to rozwiązać, zmniejszając rozmiar próbki tkanki. Jedną z zalet wiązania aldehydem glutarowym jest to, że może oferować bardziej sztywny lub ściśle związany utrwalony produkt – jego większa długość i dwie grupy aldehydowe pozwalają mu „mostkować” i łączyć bardziej odległe pary cząsteczek białka. Powoduje szybkie i nieodwracalne zmiany, dobrze nadaje się do mikroskopii elektronowej, działa dobrze w temperaturze 4 °C i daje najlepsze ogólne szczegóły cytoplazmatyczne i jądrowe. Nie jest to jednak idealne rozwiązanie do barwienia immunohistochemicznego.
Niektóre protokoły utrwalania wymagają połączenia formaldehydu i aldehydu glutarowego, tak aby ich mocne strony wzajemnie się uzupełniały.
Te środki utrwalające sieciowania, szczególnie formaldehydu, zazwyczaj w celu zachowania struktury drugorzędowej w białka i może również zachowanie większości strukturę trzeciorzędową .
Utrwalacze strącające – alkohole
Wytrącające (lub denaturujące ) środki utrwalające działają poprzez zmniejszanie rozpuszczalności cząsteczek białek i często poprzez zakłócanie oddziaływań hydrofobowych, które nadają wielu białkom ich trzeciorzędową strukturę. Wytrącanie i agregację białek jest bardzo różny od procesu sieciowania, który występuje utrwalaczy aldehydu.
Najczęstszymi utrwalaczami strącającymi są etanol i metanol . Są powszechnie używane do utrwalania zamrożonych skrawków i rozmazów. Aceton jest również stosowany i wykazano, że zapewnia lepszą konserwację histologiczną niż skrawki zamrożone, gdy jest stosowany w technice acetonu metylobenzoesanu ksylenu (AMEX).
Metanol, etanol i aceton denaturujący białko są rzadko używane do utrwalania bloków, chyba że bada się kwasy nukleinowe.
Kwas octowy jest środkiem denaturującym, który jest czasami stosowany w połączeniu z innymi strącającymi środkami utrwalającymi, takimi jak AFA Davidsona. Wiadomo, że alkohole same w sobie powodują znaczne kurczenie się i twardnienie tkanki podczas utrwalania, podczas gdy sam kwas octowy jest związany z pęcznieniem tkanki; połączenie tych dwóch może skutkować lepszym zachowaniem morfologii tkanek .
Utleniacze
Utrwalacze utleniające mogą reagować z łańcuchami bocznymi białek i innych biocząsteczek, umożliwiając tworzenie wiązań sieciujących, które stabilizują strukturę tkanki. Powodują jednak rozległą denaturację pomimo zachowania drobnej struktury komórkowej i są stosowane głównie jako utrwalacze wtórne.
Czterotlenek osmu jest często używany jako wtórny środek utrwalający, gdy próbki są przygotowywane do mikroskopii elektronowej . (Nie jest używany do mikroskopii świetlnej, ponieważ bardzo słabo penetruje grube fragmenty tkanki.)
Dwuchromian potasu , kwas chromowy i nadmanganian potasu znajdują zastosowanie w określonych preparatach histologicznych.
Mercurials
Mercuriale, takie jak B-5 i utrwalacz Zenkera, mają nieznany mechanizm, który zwiększa jasność barwienia i zapewnia doskonałe odwzorowanie szczegółów jądra. Pomimo tego, że są szybkie, rtęci słabo penetrują i powodują kurczenie się tkanek. Ich najlepsze zastosowanie to utrwalanie tkanek krwiotwórczych i siateczkowo-śródbłonkowych. Należy również pamiętać, że ponieważ zawierają rtęć, należy zachować ostrożność przy ich usuwaniu.
Pikraci
Pikrynianie dobrze penetrują tkankę, reagując z histonami i białkami zasadowymi, tworząc krystaliczne pikryniany z aminokwasami i wytrącając wszystkie białka. Jest dobrym środkiem utrwalającym tkankę łączną, dobrze konserwuje glikogen i ekstrahuje lipidy, dając lepsze wyniki niż formaldehyd w immunobarwieniu hormonów biogennych i polipeptydowych. Jednak powoduje utratę bazofilów, chyba że próbka zostanie dokładnie przemyta po utrwaleniu.
Utrwalacz NADZIEJA
Efekt ochrony rozpuszczalnika organicznego za pośrednictwem buforu kwasu hepes-glutaminowego (HOPE) zapewnia morfologię podobną do formaliny, doskonałe zachowanie antygenów białkowych dla immunohistochemii i histochemii enzymów, dobrą wydajność RNA i DNA oraz brak białek sieciujących.
Bibliografia
Zewnętrzne linki
|
Zasoby biblioteczne dotyczące fiksacji (histologia) |