Chromatografia kolumnowa - Column chromatography
Chromatografia kolumnowa w chemii to metoda chromatografii stosowana do wyodrębnienia pojedynczego związku chemicznego z mieszaniny. Chromatografia jest w stanie oddzielić substancje na podstawie różnicowej adsorpcji związków na adsorbencie; związki przemieszczają się przez kolumnę z różną szybkością, umożliwiając rozdzielenie ich na frakcje. Technika ta ma szerokie zastosowanie, ponieważ wiele różnych adsorbentów (faza normalna, faza odwrócona lub inne) może być używanych z szeroką gamą rozpuszczalników. Technika ta może być stosowana na wagach od mikrogramów do kilogramów. Główną zaletą chromatografii kolumnowej jest stosunkowo niski koszt i możliwość utylizacji fazy stacjonarnej stosowanej w procesie. Ten ostatni zapobiega zanieczyszczeniu krzyżowemu i stacjonarnej degradacji w fazie w wyniku recyklingu. Chromatografię kolumnową można przeprowadzić wykorzystując grawitację do przemieszczania rozpuszczalnika lub używając sprężonego gazu do przepychania rozpuszczalnika przez kolumnę.
Chromatografii cienkowarstwowej można pokazać, jak mieszanina związków będzie zachowywać się po oczyszczeniu metodą chromatografii kolumnowej. Rozdział jest najpierw optymalizowany przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej przed wykonaniem chromatografii kolumnowej.
Przygotowanie kolumny
Kolumnę przygotowuje się przez umieszczenie stałego absorbentu w cylindrycznej szklanej lub plastikowej rurce. Rozmiar będzie zależał od ilości izolowanego związku. Podstawa probówki zawiera filtr, zatyczkę z bawełny lub waty szklanej lub szklaną frytę, aby utrzymać fazę stałą na miejscu. U góry kolumny można zamocować zbiornik na rozpuszczalnik.
Generalnie do przygotowania kolumny stosuje się dwie metody: metodę suchą i metodę mokrą. W przypadku metody suchej kolumnę najpierw napełnia się suchym proszkiem fazy stacjonarnej, a następnie dodaje się fazę ruchomą, która jest przepłukiwana przez kolumnę aż do całkowitego zwilżenia i od tego momentu nie może już wysychać. W przypadku metody mokrej eluent sporządza się z zawiesiny z proszkiem fazy stacjonarnej, a następnie ostrożnie wlewa do kolumny. Wierzchołek krzemionki powinien być płaski, a wierzch krzemionki można zabezpieczyć warstwą piasku. Eluent powoli przepuszcza się przez kolumnę, aby przesunąć materiał organiczny.
Poszczególne składniki są zatrzymywane przez fazę stacjonarną w różny sposób i oddzielone od siebie, podczas gdy przepływają z różnymi prędkościami przez kolumnę z eluentem. Na końcu kolumny eluują pojedynczo. Podczas całego procesu chromatografii eluent zbiera się w serii frakcji . Frakcje można zbierać automatycznie za pomocą kolektorów frakcji. Wydajność chromatografii można zwiększyć, uruchamiając kilka kolumn jednocześnie. W tym przypadku stosowane są kolektory wielostrumieniowe. Można monitorować skład przepływu eluentu i każdą frakcję analizować pod kątem rozpuszczonych związków, np. Metodą chromatografii analitycznej, widm absorpcji UV lub fluorescencji . Związki barwne (lub związki fluorescencyjne za pomocą lampy UV) można zobaczyć przez szklaną ścianę w postaci ruchomych pasm.
Faza stacjonarna
Faza stacjonarna lub adsorbent w chromatografii kolumnowej jest ciałem stałym. Najbardziej powszechną fazą stacjonarną w chromatografii kolumnowej jest żel krzemionkowy , a następną najczęściej stosowaną fazą jest tlenek glinu . W przeszłości często stosowano proszek celulozowy . Dostępna jest szeroka gama faz stacjonarnych do wykonywania chromatografii jonowymiennej , chromatografii z odwróconymi fazami (RP), chromatografii powinowactwa lub adsorpcji w złożu ekspandowanym (EBA). Do fazy stacjonarne są zazwyczaj drobno zmielone proszki lub żele i / lub są na mikroporowatej zwiększoną powierzchnię, ale w EBA stosuje się złoże fluidalne. Istnieje istotny stosunek między masą fazy stacjonarnej a masą suchej mieszaniny analitów, którą można nałożyć na kolumnę. W przypadku chromatografii kolumnowej na krzemionce stosunek ten mieści się w zakresie od 20: 1 do 100: 1, w zależności od tego, jak blisko siebie eluowane są składniki analitu.
Faza ruchoma (eluent)
Faza ruchoma lub eluent to rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników używanych do przemieszczania związków przez kolumnę. Wybiera się tak, aby wartość współczynnika retencji związku będącego przedmiotem zainteresowania wynosiła w przybliżeniu około 0,2 - 0,3 w celu zminimalizowania czasu i ilości eluentu do przeprowadzenia chromatografii. Eluent został również dobrany tak, aby można było skutecznie rozdzielić różne związki. Eluent jest optymalizowany w testach wstępnych na małą skalę, często przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej (TLC) z tą samą fazą stacjonarną.
Dla każdego oddzielenia istnieje optymalne natężenie przepływu . Szybszy przepływ eluentu minimalizuje czas wymagany do uruchomienia kolumny, a tym samym minimalizuje dyfuzję, co skutkuje lepszym rozdziałem. Jednak maksymalne natężenie przepływu jest ograniczone, ponieważ analit potrzebuje określonego czasu, aby osiągnąć równowagę między fazą stacjonarną i ruchomą, patrz równanie Van Deemtera . Prosta kolumna laboratoryjna działa grawitacyjnie . Szybkość przepływu takiej kolumny można zwiększyć przez wysunięcie kolumny wypełnionej świeżym eluentem powyżej szczytu fazy stacjonarnej lub zmniejszyć za pomocą regulatorów spustowych. Szybsze szybkości przepływu można osiągnąć, stosując pompę lub stosując sprężony gaz (np. Powietrze, azot lub argon ) do przepychania rozpuszczalnika przez kolumnę (chromatografia kolumnowa typu flash).
Wielkość cząstek fazy stacjonarnej jest na ogół drobniejsza w chromatografii kolumnowej typu flash niż w kolumnowej chromatografii grawitacyjnej. Na przykład, jednym z najpowszechniej stosowanych gatunków żelu krzemionkowego w pierwszej technice jest siatka 230 - 400 (40 - 63 µm), podczas gdy druga technika zwykle wymaga siatki 70 - 230 (63 - 200 µm) żelu krzemionkowego.
Opracowano arkusz kalkulacyjny, który pomaga w pomyślnym opracowaniu kolumn flash. Arkusz kalkulacyjny szacuje objętość retencji i objętość pasma analitów, liczby frakcji, które mają zawierać każdy analit oraz rozdzielczość między sąsiednimi pikami. Informacje te pozwalają użytkownikom na wybranie optymalnych parametrów dla separacji w skali preparatywnej przed próbą wykonania samej kolumny flash.
Systemy automatyczne
Chromatografia kolumnowa jest niezwykle czasochłonnym etapem w każdym laboratorium i może szybko stać się wąskim gardłem w każdym laboratorium procesowym. Wielu producentów, takich jak Biotage, Buchi, Interchim i Teledyne Isco, opracowało zautomatyzowane systemy do szybkiej chromatografii (zwykle określane jako LPLC, niskociśnieniowa chromatografia cieczowa, około 350–525 kPa lub 50,8–76,1 psi), które minimalizują udział człowieka w procesie oczyszczania. Systemy zautomatyzowane będą zawierały elementy zwykle spotykane w droższych systemach wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), takie jak pompa gradientowa, porty do wstrzykiwania próbek, detektor UV i kolektor frakcji do zbierania eluentu. Zazwyczaj te zautomatyzowane systemy mogą oddzielać próbki od kilku miligramów do przemysłowej skali wielu kilogramów i oferują znacznie tańsze i szybsze rozwiązanie do wykonywania wielokrotnych wstrzyknięć w systemach prep-HPLC.
Rozdzielczość (lub zdolność do oddzielania mieszaniny) w systemie LPLC zawsze będzie niższa w porównaniu do HPLC, ponieważ materiał wypełniający w kolumnie HPLC może być znacznie mniejszy, zwykle tylko 5 mikrometrów, zwiększając w ten sposób powierzchnię fazy stacjonarnej, zwiększając interakcje powierzchniowe i dając lepszą separację. Jednak użycie tego małego środka wypełniającego powoduje wysokie ciśnienie wsteczne i dlatego nazywa się je wysokociśnieniową chromatografią cieczową. Kolumny LPLC są zwykle wypełnione krzemionką o grubości około 50 mikrometrów, co zmniejsza ciśnienie wsteczne i rozdzielczość, ale eliminuje również potrzebę stosowania drogich pomp wysokociśnieniowych. Producenci zaczynają teraz przechodzić na systemy do wysokociśnieniowej chromatografii błyskawicznej i określają je jako systemy średniociśnieniowej chromatografii cieczowej (MPLC), które działają powyżej 1 MPa (150 psi).
Obliczanie rozdzielczości chromatogramu kolumnowego
Zazwyczaj chromatografię kolumnową ustawia się za pomocą pomp perystaltycznych, przepływających buforów i próbki roztworu przez szczyt kolumny. Roztwory i bufory przechodzą przez kolumnę, gdzie kolektor frakcji na końcu układu kolumny zbiera eluowane próbki. Przed pobraniem frakcji próbki, które są eluowane z kolumny, przechodzą przez detektor, taki jak spektrofotometr lub spektrometr mas, dzięki czemu można określić stężenie oddzielonych próbek w mieszaninie roztworu próbki.
Na przykład, jeśli miałbyś oddzielić dwa różne białka o różnych zdolnościach wiązania do kolumny z próbki roztworu, dobrym typem detektora byłby spektrofotometr wykorzystujący długość fali 280 nm. Im wyższe stężenie białka, które przechodzi przez eluowany roztwór przez kolumnę, tym wyższa absorbancja przy tej długości fali.
Ponieważ chromatografia kolumnowa ma stały przepływ wymytego roztworu przechodzącego przez detektor przy różnych stężeniach, detektor musi wykreślić stężenie wymytej próbki w czasie. Ten wykres stężenia próbki w funkcji czasu nazywa się chromatogramem.
Ostatecznym celem chromatografii jest oddzielenie różnych składników z mieszaniny roztworów. Rozdzielczość wyraża stopień oddzielenia składników mieszaniny. Im wyższa rozdzielczość chromatogramu, tym lepszy stopień rozdziału próbek w kolumnie. Te dane są dobrym sposobem określenia właściwości separacji kolumny w tej konkretnej próbce. Rozdzielczość można obliczyć na podstawie chromatogramu.
Oddzielne krzywe na diagramie przedstawiają różne profile stężeń elucji próbki w czasie w oparciu o ich powinowactwo do żywicy kolumny. Aby obliczyć rozdzielczość, wymagany jest czas retencji i szerokość krzywej.
Czas retencji to czas od początku wykrywania sygnału przez detektor do wysokości piku profilu stężenia elucji dla każdej innej próbki.
Szerokość krzywej to szerokość krzywej profilu stężenia różnych próbek na chromatogramie w jednostkach czasu.
Uproszczoną metodą obliczania rozdzielczości chromatogramu jest wykorzystanie modelu płytki. Model płytowy zakłada, że kolumnę można podzielić na określoną liczbę sekcji lub płyt, a bilans masy można obliczyć dla każdej pojedynczej płyty. To podejście przybliża typową krzywą chromatogramu jako krzywą rozkładu Gaussa . W ten sposób szerokość krzywej jest szacowana jako 4-krotność odchylenia standardowego krzywej, 4σ. Czas retencji to czas od początku wykrycia sygnału do czasu wysokości piku krzywej Gaussa.
Ze zmiennych przedstawionych na powyższym rysunku rozdzielczość, numer i wysokość płyty kolumny można obliczyć za pomocą równań:
Rozdzielczość (R s )
R s = 2 (t RB - t RA ) / (w B + w A )
gdzie:
t RB = czas retencji substancji rozpuszczonej B
t RA = czas retencji substancji rozpuszczonej A
w B = szerokość krzywej gaussowskiej substancji rozpuszczonej B
w A = szerokość krzywej gaussowskiej substancji rozpuszczonej A
Numer płytki (N):
N = (t R ) 2 / (w / 4) 2
Wysokość płyty (H):
H = L / N
Gdzie L jest długością kolumny.
Równowaga adsorpcji w kolumnie
W przypadku kolumny adsorpcyjnej żywica kolumny (faza stacjonarna) składa się z mikrokulek. Nawet mniejsze cząsteczki, takie jak białka, węglowodany, jony metali lub inne związki chemiczne, są sprzężone z mikrokulkami. Można założyć, że każda cząsteczka wiążąca, która jest przyłączona do mikrokulki, wiąże się w stosunku 1: 1 z próbką substancji rozpuszczonej przesłaną przez kolumnę, która wymaga oczyszczenia lub oddzielenia.
Wiązanie między cząsteczką docelową, która ma być oddzielona, a cząsteczką wiążącą na kulkach kolumny można modelować za pomocą prostej reakcji równowagi K eq = [CS] / ([C] [S]), gdzie K eq jest stałą równowagi , [C] a [S] to odpowiednio stężenia cząsteczki docelowej i cząsteczki wiążącej na żywicy kolumny. [CS] to stężenie kompleksu cząsteczki docelowej związanej z żywicą kolumny.
Na tej podstawie można zastosować trzy różne izotermy do opisania dynamiki wiązania chromatografii kolumnowej: liniowej, Langmuira i Freundlicha.
Liniowa izoterma występuje, gdy stężenie substancji rozpuszczonej potrzebne do oczyszczenia jest bardzo małe w stosunku do cząsteczki wiążącej. Zatem równowagę można zdefiniować jako:
[CS] = K eq [C].
W przypadku zastosowań na skalę przemysłową należy uwzględnić całkowitą liczbę cząsteczek wiążących na kulkach żywicy kolumny, ponieważ należy uwzględnić wolne miejsca. Izotermy Langmuira i Freundlicha izoterma są użyteczne w opisie tej równowagi. Izoterma Langmuira:
[CS] = (K eq S tot [C]) / (1 + K eq [C]), gdzie S tot to suma cząsteczek wiążących na kulkach.
Izoterma Freundlicha:
[CS] = K eq [C] 1 / n
Izotermę Freundlicha stosuje się, gdy kolumna może wiązać się z wieloma różnymi próbkami w roztworze, który wymaga oczyszczenia. Ponieważ wiele różnych próbek ma różne stałe wiązania kulek, istnieje wiele różnych Keq. Dlatego izoterma Langmuira nie jest dobrym modelem wiązania w tym przypadku.
Zobacz też
- Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) do chromatografii kolumnowej pod wysokim ciśnieniem.
- Szybka chromatografia cieczowa białek (FPLC) do rozdziału białek za pomocą chromatografii kolumnowej.